Pipetty電動(dòng)移液器在犬細(xì)小病毒檢測(cè)（HI實(shí)驗(yàn)）中的應(yīng)用

方案摘要：犬細(xì)小病毒 HI 實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)犬血清中 CPV 特異性抗體的經(jīng)典血清學(xué)方法，核心用于評(píng)估犬只免疫狀態(tài)、追溯既往感染，不直接檢測(cè)病毒抗原。為提升實(shí)驗(yàn)效率，實(shí)驗(yàn)采用了Pipetty電動(dòng)移液器，這款移液器擁有輕便小巧的特點(diǎn)，重量?jī)H 75g，操作起來(lái)十分舒適。同時(shí)，它具備高精度的等量連續(xù)分液能力，能夠按照設(shè)定的移液量進(jìn)行多次重復(fù)排液，并且配備了溫度控制功能，可避免因手部熱量影響而導(dǎo)致的精度降低。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       犬細(xì)小病毒 HI 實(shí)驗(yàn)核心基于犬細(xì)小病毒（CPV）的血凝特性與特異性抗體的抑制作用，用于檢測(cè)血清中 CPV 特異性抗體。首先，CPV（尤其 CPV-2 型及變異株）可特異性結(jié)合豬紅細(xì)胞表面受體，使紅細(xì)胞脫離懸浮狀態(tài)、聚集成團(tuán)，形成肉眼可見的絮狀沉淀，此為 “血凝反應(yīng)”。若待檢血清中存在 CPV 特異性抗體，抗體將優(yōu)先與 CPV 結(jié)合形成抗原 - 抗體復(fù)合物，占據(jù) CPV 上能結(jié)合紅細(xì)胞的位點(diǎn)，從而阻斷 CPV 與紅細(xì)胞的相互作用，抑制血凝反應(yīng)發(fā)生。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)血清進(jìn)行倍比稀釋，觀察不同稀釋度下是否出現(xiàn)血凝抑制，可確定 “完全抑制血凝的最高血清稀釋度”，即 CPV 抗體滴度，以此量化血清中 CPV 抗體的水平。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 冰箱（4 ℃、20 ℃、-70 ℃）；
③ 恒溫培養(yǎng)箱（5℃~100℃）；
④ 微型混合器；
⑤ 96孔V形微量反應(yīng)板。
 
2、試劑和材料
① PBS；
② 1%豬紅細(xì)胞懸液；
③ CPV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、根據(jù)測(cè)定好的病毒血凝效價(jià)，配制4個(gè)血凝單位（4HAU）病毒液。若血凝的終點(diǎn)滴度為1:256，則4HAU=256/4=64（即1:64），即通過(guò)1:64稀釋獲得4HAU病毒液。
2、使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置M連續(xù)分液模式，在96孔V形微量反應(yīng)板上，第1孔~第11孔中各加入25μLPBS。在第12孔加入50μL PBS作為紅細(xì)胞對(duì)照。
 
3、使用單次分液模式，取25μL CPV陽(yáng)性血清加入左側(cè)第1孔，按UP鍵進(jìn)入混勻模式，自動(dòng)混勻后，吸出25μL至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，從第10孔中吸出25μL棄掉。
 
4、使用M連續(xù)分液模式，在第1孔~第11孔中加入配制好的4HAU病毒液 25μL，置于微型混合器上振蕩10s，混合均勻，在37℃條件下靜置60min。第11孔作為4HAU病毒液對(duì)照。
5、使用M連續(xù)分液模式，由左至右依次向每孔加入25μL 1%豬紅細(xì)胞懸液，置于微型混合器上振蕩10s，混合均勻，在4℃條件下靜置30min~60min，待第11孔4HAU病毒液對(duì)照孔出現(xiàn)紅細(xì)胞100%凝集時(shí)可觀察結(jié)果。
四、結(jié)果判定
將96孔V形微量反應(yīng)板傾斜，觀察4HAU病毒液血凝性是否被CPV陽(yáng)性血清特異性抑制，紅細(xì)胞有無(wú)淚珠狀流淌。當(dāng)4HAU病毒液對(duì)照孔紅細(xì)胞完全凝集，PBS對(duì)照孔紅細(xì)胞呈現(xiàn)淚珠狀流淌，則試驗(yàn)成立。能被CPV陽(yáng)性血清抑制血凝者，判為CPV陽(yáng)性；不能被CPV陽(yáng)性血清抑制血凝者，判為CPV陰性。