基因敲除鼠、點(diǎn)突變鼠、報(bào)告基因工具鼠等小鼠模型的常見問題及解答

又是一年開學(xué)時(shí)刻！鼠博士不禁哼起小調(diào)：
美美September，手里握著課題，
知識點(diǎn)匯聚交集，讓我們來一起選動物模型~

鼠博士為大家貼心總結(jié)了常見的問題，大家可以按需查看推薦模型：
1. 如何研究目的基因的功能？→基因敲除鼠
2. 如何研究目的基因點(diǎn)突變的功能？→點(diǎn)突變鼠
3. 如何精準(zhǔn)定位目的基因的表達(dá)區(qū)域？→報(bào)告基因工具鼠
4. 如何實(shí)現(xiàn)目的基因在特異組織或特異時(shí)間表達(dá)？→Cre工具鼠
5. 如何研究表達(dá)目的基因的細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮的作用？→細(xì)胞剔除工具鼠
6. 如何在小鼠模型上進(jìn)行免疫、腫瘤、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)研究？→免疫缺陷鼠
7. 如何在小鼠模型上更好地模擬腫瘤的發(fā)生發(fā)展等機(jī)制？→基因修飾的自發(fā)腫瘤鼠
8. 如何在小鼠模型上研究人類基因功能或進(jìn)行藥理藥效研究？→人源化鼠

圖1. Pah-KO小鼠模型產(chǎn)生類苯丙酮尿癥表型：體重、腦重降低

如果需要學(xué)習(xí)基因敲除鼠的進(jìn)階使用技巧，可以參考我們的往期推文：什么！你的敲除鼠還能檢測到蛋白條帶？

02
問題：如何研究目的基因點(diǎn)突變的功能？
推薦模型：點(diǎn)突變大小鼠模型
點(diǎn)突變在基因組進(jìn)化的過程中十分常見，且在致病性遺傳變異的占比較高，這意味著點(diǎn)突變?nèi)菀渍T發(fā)各類疾病。通過對小鼠的基因組進(jìn)行修飾，將目標(biāo)點(diǎn)突變對應(yīng)的基因片段導(dǎo)入到小鼠早期胚胎，并使其整合到基因組中，可以獲得點(diǎn)突變小鼠模型。點(diǎn)突變模型是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病、罕見病、癌癥等領(lǐng)域的重要工具。

圖2. 利用Col4a5-R471X小鼠模型模擬Alport綜合征

往期推文：國際罕見病日｜南模生物助力罕見病藥物研發(fā)

03 問題：如何精準(zhǔn)定位目的基因的表達(dá)區(qū)域？
推薦模型：報(bào)告基因大小鼠模型
通過基因修飾將報(bào)告基因整合到大小鼠的基因組中，這樣就構(gòu)建出了攜帶報(bào)告基因的工具鼠。當(dāng)報(bào)告基因表達(dá)時(shí)，我們可以借助實(shí)驗(yàn)儀器觀察到其在組織或細(xì)胞水平的表達(dá)情況，實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)監(jiān)測，還可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)記、譜系示蹤等“玩法”。

熒光蛋白：熒光蛋白家族（fluorescent protein family）是從水螅蟲綱和珊瑚類動物中發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量為(2～3)×10⁴的同源蛋白，包括綠色、紅色、黃色和青色熒光蛋白等。其發(fā)光原理是，相應(yīng)的發(fā)色基團(tuán)經(jīng)一定波長的激發(fā)光照射后被激活，并將能量以光能形式釋放。常用于研究目的基因表達(dá)，蛋白質(zhì)運(yùn)輸以及各種細(xì)胞內(nèi)動態(tài)的生物化學(xué)信號通路等。

圖3. 利用熒光蛋白研究心臟發(fā)育或再生機(jī)制^[1]

而進(jìn)階版策略——譜系示蹤，在多種生物研究領(lǐng)域也有著優(yōu)秀的應(yīng)用：細(xì)胞譜系追蹤技術(shù)通常是指使用各種手段對某類祖細(xì)胞亞群進(jìn)行標(biāo)記，在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)對其分化命運(yùn)進(jìn)行檢測，它對于揭開多樣的、基礎(chǔ)的生物學(xué)過程中的分子機(jī)制是非常關(guān)鍵，因此一直以來建立能夠在體內(nèi)進(jìn)行追蹤細(xì)胞譜系的動物模型是生物學(xué)研究的一個(gè)長期目標(biāo)。

圖4. 譜系追蹤策略示意圖^[2]

想要深入學(xué)習(xí)的同學(xué)可以閱覽我們的往期推文合集：譜系示蹤

04 問題：如何實(shí)現(xiàn)目的基因在特異組織或特異時(shí)間表達(dá)？
推薦模型：Cre工具鼠
Cre-Lox系統(tǒng)是一種操作簡單、重組率高的基因編輯技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞、組織或整個(gè)生物體，甚至在特定時(shí)間點(diǎn)敲除或表達(dá)某個(gè)基因。其本質(zhì)是一個(gè)來自P1噬菌體的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。“基礎(chǔ)款”Cre-lox由兩個(gè)核心部分組成：Cre重組酶+LoxP位點(diǎn)。

Cre重組酶：Cre重組酶由噬菌體P1的環(huán)化重組酶基因產(chǎn)生的一個(gè)38 kDa的DNA重組酶，能特異性地識別Loxp位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)DNA片段的重組。LoxP位點(diǎn)：LoxP位點(diǎn)是一段長度為34bp的特定DNA序列，由兩個(gè)13bp的反向回文重復(fù)序列和8bp的中間間隔序列組成。只有兩個(gè)序列相同的Lox位點(diǎn)之間才能發(fā)生重組。

圖5. Cre-LoxP系統(tǒng)及其常見重組事件

根據(jù)lox位點(diǎn)的排列方向和位置，Cre重組酶能介導(dǎo)片段發(fā)生以下三種重組事件。Deletion（刪除）：當(dāng)兩個(gè)Lox位點(diǎn)在同一染色體上且方向相同時(shí)，兩個(gè)Lox位點(diǎn)之間的序列將被刪除。Inversion（倒轉(zhuǎn)）：當(dāng)兩個(gè)Lox位點(diǎn)位于同一染色體上且方向相反時(shí)，兩個(gè)Lox位點(diǎn)之間的序列將發(fā)生序列倒轉(zhuǎn)。Translocation（易位）：當(dāng)兩個(gè)Lox位點(diǎn)位于不同的染色體上且方向相同，將導(dǎo)致2條染色體上DNA片段的交換。

利用Cre-lox系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因的特異性表達(dá)或敲除，原則上需要建立兩種小鼠：Cre工具鼠與Flox小鼠。Cre工具鼠為攜帶Cre重組酶的基因修飾小鼠，Cre重組酶由特定啟動子驅(qū)動，可在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)；Flox小鼠是在靶基因序列兩側(cè)插入Lox位點(diǎn)的基因修飾小鼠。通過將上述兩種小鼠交配繁育，即可獲得基因條件性敲除或過表達(dá)小鼠。

圖6. 熒光檢測Pvalb^Cre+/-; Rosa26^tdTomato+/-小鼠大腦皮層中間神經(jīng)元tdTomato的表達(dá)�？梢娂t色陽性信號。

為更準(zhǔn)確地進(jìn)行遺傳功能研究，時(shí)間特異性的Cre-lox（也叫誘導(dǎo)型Cre-lox）被開發(fā)出來，如CreER系統(tǒng)，將Cre改造為與雌激素受體ER融合的蛋白CreER（或CreERT2），可在特定時(shí)間點(diǎn)利用tamoxifen激活Cre重組酶的功能，實(shí)現(xiàn)目的基因的時(shí)空特異性表達(dá)/敲除。

圖7. Tamoxifen誘導(dǎo)的Cre-ER系統(tǒng)原理^[3]

往期推文：小鼠大學(xué)問 | Cre-Lox系統(tǒng)核心原理全解析

05 問題：如何研究表達(dá)目的基因的細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮的作用？
推薦模型：細(xì)胞剔除工具鼠
想要驗(yàn)證細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮的功能，可以使用細(xì)胞剔除策略，即通過選擇性地移除或殺死特定類型的細(xì)胞，來觀察對機(jī)體的影響。細(xì)胞剔除策略可以幫助構(gòu)建疾病模型、研究多種疾病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展、促進(jìn)細(xì)胞或組織移植的治療研究等。目前DTR模型或DTA模型的使用是較為廣泛的。

DTR小鼠，即白喉毒素受體（diphtheria toxin receptor, DTR）小鼠，是通過基因編輯技術(shù)將肝素結(jié)合EGF樣生長因子前體的受體基因?qū)�入到小鼠的特定�?xì)胞中，從而使這些細(xì)胞對白喉毒素（DT）敏感。給DTR小鼠注射DT后，表達(dá)了DTR的細(xì)胞會被特異性地清除，而其他細(xì)胞則不受影響。
 

圖8. 納米結(jié)構(gòu)在DC細(xì)胞耗竭的DTR模型小鼠中的抗腫瘤能力下降^[4]

往期推文：細(xì)胞條件性剔除：DTR小鼠助力細(xì)胞功能研究

除了DTR小鼠模型，DTA（DT subunit alpha gene）小鼠模型可通過直接表達(dá)毒素亞基A，導(dǎo)致細(xì)胞自主性死亡，達(dá)到細(xì)胞剔除的效果，無需外部注射DT。通過將表達(dá)DTA的flox小鼠與Cre小鼠進(jìn)行配繁，還能實(shí)現(xiàn)在特定細(xì)胞中直接表達(dá)DTA直接介導(dǎo)細(xì)胞的特異性剔除。

圖9. 利用DTA模型實(shí)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性剔除^[5]

往期推文：無需DT！DTA小鼠精準(zhǔn)驅(qū)動細(xì)胞條件性剔除

06 問題：如何更好地在小鼠模型上進(jìn)行免疫、腫瘤、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)研究？
推薦模型：免疫缺陷鼠模型
免疫缺陷小鼠是指一種或多種免疫系統(tǒng)組成成分缺陷的小鼠，南模生物擁有多種免疫缺陷大小鼠，這些模型不僅可以用作大小鼠腫瘤細(xì)胞、人腫瘤細(xì)胞系和人源性異體移植腫瘤的移植宿主，還能用于人體免疫系統(tǒng)研究的諸多方面。常見的免疫缺陷鼠有以下幾類：

表1. 免疫缺陷鼠分類及其免疫細(xì)胞缺陷差別

往期推文：超清晰！選對免疫缺陷小鼠全靠這篇~
往期推文：M-SRG大鼠 | 免疫缺陷大鼠，不只有大一個(gè)優(yōu)點(diǎn)

由于人類病原體或針對人類細(xì)胞開發(fā)的藥物也具有種屬特異性，在免疫健全的小鼠模型中無法很好的重現(xiàn)疾病的發(fā)生發(fā)展，所以，具有人類免疫系統(tǒng)、能夠模仿人體免疫機(jī)能和病理表現(xiàn)的人源化小鼠模型——免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型——就成為了更趁手的工具。在免疫人源化小鼠模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行免疫重建，即可有效模擬人類疾病發(fā)展。免疫重建模型主要有幾種類型：

Hu-PBMC：通過移植人外周血單核細(xì)胞（PBMC）至重度免疫缺陷小鼠體內(nèi)構(gòu)建。

圖10. Hu-PBMC模型重建流程示意圖

Hu-HSC：通過移植CD34+/造血干細(xì)胞（hsc）至重度免疫缺陷小鼠體內(nèi)構(gòu)建。

圖11. Hu-HSC模型重建流程示意圖

此外，南模生物還有更多M-NSG衍生品系可供選擇：

圖12. M-NSG的衍生品系分類

往期推文：M-NSG Pro系列 | 這些小鼠，讓免疫重建更進(jìn)一步

07 問題：如何在體內(nèi)研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展等機(jī)制？
推薦模型：基因修飾原發(fā)腫瘤小鼠模型
基因修飾原發(fā)腫瘤小鼠模型是通過改造小鼠基因而構(gòu)建的原發(fā)腫瘤模型。通常針對小鼠的原癌基因/抑癌基因進(jìn)行基因修飾，干擾或調(diào)節(jié)其表達(dá)規(guī)律，誘發(fā)腫瘤模型。該類模型的優(yōu)勢在于可以模擬腫瘤早期進(jìn)展特征和自發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生機(jī)制研究、腫瘤藥物篩選和評估以及免疫治療研究中發(fā)揮了重要的作用。

圖13. Stk11/EGFP/Kras-LSL-G12D來源細(xì)胞系的抗腫瘤藥效評價(jià)

往期推文：基因修飾原發(fā)腫瘤小鼠模型，為您的科研一鍵加速！

08 問題：如何在小鼠模型上研究人類基因功能或進(jìn)行藥理藥效研究？
推薦模型：人源化小鼠模型
人源化小鼠模型是指通過基因工程技術(shù)或細(xì)胞移植技術(shù)，將人類特定的生物分子（如基因）、細(xì)胞或組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，從而使小鼠能夠部分模擬人類的生物學(xué)特性。篩選合適的目的基因構(gòu)建人源化小鼠模型，即可用于模擬人類疾病、研究腫瘤靶點(diǎn)、炎癥/自身免疫性疾病靶點(diǎn)、創(chuàng)新藥物（如抗體類藥物、小核酸類藥物）的臨床前藥效評估等。

圖14. IMQ誘導(dǎo)的人源化小鼠hIL17A/hIL17F構(gòu)建Psoriasis模型

往期推文：U-HuDTMbase®來襲！為您提供專“鼠”藥物研究革命性模型

關(guān)于我們
上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評價(jià)等多個(gè)技術(shù)平臺，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動物模型產(chǎn)品解決方案。

Reference：
[1] Li Y, Lv Z, He L, et al. Genetic Tracing Identifies Early Segregation of the Cardiomyocyte and Nonmyocyte Lineages. Circ Res. 2019;125(3):343-355. doi:10.1161/CIRCRESAHA.119.315280.
[2] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020;295(19):6413-6424. doi:10.1074/jbc.REV120.011631.
[3] Kim H, Kim M, Im SK, Fang S.Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles oftarget genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147‐159. doi:10.5625/lar.2018.34.4.147.
[4] Tan M, Cao G, Wang R, Cheng L, Huang W, Yin Y, Ma H, Ho SH, Wang Z, Zhu M, Ran H, Nie G, Wang H. Metal-ion-chelating phenylalanine nanostructures reverse immune dysfunction and sensitize breast tumour to immune checkpoint blockade. Nat Nanotechnol. 2024 Dec;19(12):1903-1913. doi: 10.1038/s41565-024-01758-3. Epub 2024 Aug 26. PMID: 39187583.
[5] Tsai HH, Li H, Fuentealba LC, Molofsky AV, Taveira-Marques R, Zhuang H, Tenney A, Murnen AT, Fancy SP, Merkle F, Kessaris N, Alvarez-Buylla A, Richardson WD, Rowitch DH. Regional astrocyte allocation regulates CNS synaptogenesis and repair. Science. 2012 Jul 20;337(6092):358-62. doi: 10.1126/science.1222381. Epub 2012 Jun 28. PMID: 22745251; PMCID: PMC4059181.