丘腦皮質(zhì)神經(jīng)元的實時直接去極化對全身性失神癲癇網(wǎng)絡(luò)進行雙向控制
為探究丘腦皮質(zhì)（TC）神經(jīng)元對失神發(fā)作（AS，特發(fā)性全身性癲癇標志，以雙側(cè)尖峰波放電 SWD 為特征）的作用，研究在自由行為的 GAERS 大鼠（成熟 AS 模型）中采用光遺傳學技術(shù)。結(jié)果顯示：安靜清醒（QW）時，丘腦腹基底核 ChR2 轉(zhuǎn)染 TC 神經(jīng)元直接去極化，可靠引發(fā)乙琥胺敏感 AS，其持續(xù)時間、頻率與自發(fā)性 AS 相近；主動覺醒（AW）時影響小，慢波睡眠（SWS）時無影響。非癲癇對照（NEC）大鼠各狀態(tài)下光刺激 TC 神經(jīng)元均不引發(fā) AS，Wistar 大鼠 QW 時僅引發(fā)短 AS。且短暫光刺激能即時阻止 GAERS 大鼠正在進行的自發(fā) AS，改變丘腦多單位活動模式。研究表明，皮質(zhì) - 丘腦 - 皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò)興奮性依賴行為狀態(tài)，QW 時 AS 誘導敏感性高，質(zhì)疑 TC 神經(jīng)元低閾值爆發(fā)放電對 AS 產(chǎn)生的必要性，同時證實 TC 神經(jīng)元對 AS 的雙重控制作用，凸顯其作為 AS 治療靶點的潛力。
研究思路
失神發(fā)作（AS）以腦電雙側(cè)尖峰波放電（SWD）、意識喪失為特征，皮質(zhì) - 丘腦 - 皮質(zhì)（CTC）網(wǎng)絡(luò)對其起關(guān)鍵作用，丘腦腹基底核（VB）的丘腦皮質(zhì)（TC）神經(jīng)元被認為參與調(diào)節(jié)，但存在爭議 —— 如 TC 神經(jīng)元 T 型鈣通道爆發(fā)放電是否為 AS 必需，體內(nèi)直接調(diào)控 TC 神經(jīng)元對 AS 的影響尚不明確。為此，研究以 GAERS 大鼠（成熟 AS 模型）為核心，用 ChR2 光遺傳學技術(shù)：① 探究 VB 區(qū) TC 神經(jīng)元直接去極化能否在發(fā)作間期誘發(fā) AS，及該過程的行為狀態(tài)依賴性、對乙琥胺的敏感性；② 在非癲癇對照（NEC）大鼠、無自發(fā) AS 的 Wistar 大鼠中驗證光刺激效果；③ 測試光刺激能否阻斷 GAERS 大鼠自發(fā) AS 及是否受 SWD 階段影響，最終揭示 TC 神經(jīng)元對 AS 的雙向調(diào)控作用及行為狀態(tài)的關(guān)鍵影響。
研究方法
本研究對 250-300g 的 GAERS、Wistar 和 NEC 大鼠展開實驗：先以 2-5% 異氟醚麻醉，固定于立體定向框架并維持 37°C 體溫，向 VB 丘腦雙側(cè)注射特定質(zhì)粒，植入帶四極管與光纖的微驅(qū)動器，同時在額葉、頂葉皮層植入螺釘記錄腦電圖，小腦螺釘作接地電極，術(shù)后大鼠至少恢復 5 天，實驗前還會讓其適應(yīng)記錄設(shè)備與特定環(huán)境。實驗日先讓大鼠適應(yīng) 30 分鐘，隨后在 10:00-16:00 同步電生理與視頻記錄，分類大鼠活動清醒（AW）、安靜清醒（QW）、慢波睡眠（SWS）狀態(tài)，保持光纖和四極管位置恒定，在不同狀態(tài)或檢測到 SWD 時給予藍光刺激，還會調(diào)整刺激參數(shù)并加入隨機延遲。研究用 Spike2 腳本半自動檢測 SWD 并結(jié)合目視驗證，結(jié)合視頻中大鼠行為確認失神發(fā)作（AS），計算癲癇發(fā)作誘導 / 阻斷百分比，用 MATLAB 計算功率譜，必要時給大鼠注射藥物。實驗結(jié)束后處理大鼠大腦評估病毒轉(zhuǎn)染與設(shè)備位置，排除 2 只數(shù)據(jù)異常大鼠，結(jié)果以均值 ± 標準誤呈現(xiàn)，用特定方法做統(tǒng)計分析。
圖1.VB中TC神經(jīng)元的通道視紫紅質(zhì)-2（ChR2）轉(zhuǎn)染
1.AS的誘導：
在安靜清醒狀態(tài)下，對 GAERS 大鼠發(fā)作間期的 VB 丘腦皮層神經(jīng)元施加單脈沖藍光刺激，能可靠誘發(fā)失神發(fā)作 —— 表現(xiàn)為腦電圖出現(xiàn)棘慢波放電，且始終伴隨行為停滯及正在進行行為的停止。這種藍光刺激誘發(fā)的失神發(fā)作，在行為、腦電特征上都與自發(fā)性失神發(fā)作高度相似，比如二者棘慢波放電的功率譜、自相關(guān)圖具有高可比性，細胞層面丘腦多單元活動也呈現(xiàn)相同的放電模式轉(zhuǎn)變，棘慢波放電的持續(xù)時間和頻率也無明顯差異。即便用特定頻率傳遞多個藍光刺激脈沖，也沒有提升單脈沖刺激對失神發(fā)作的誘發(fā)效果。
同時，藍光刺激誘發(fā)的失神發(fā)作與自發(fā)性失神發(fā)作具有相同的藥理學特征：低劑量抗癲癇藥物能對其起到部分阻斷作用，即便增加藍光刺激強度，藥物存在時誘發(fā)的棘慢波放電持續(xù)時間，仍會明顯短于用藥前。綜上，這些發(fā)現(xiàn)說明，在安靜清醒狀態(tài)下直接、選擇性興奮丘腦皮層神經(jīng)元，可在 GAERS 大鼠中誘導出與自發(fā)性失神發(fā)作特征相似的失神發(fā)作。
圖2 VB TC神經(jīng)元的選擇性光刺激（LS）在 GAERS 中引發(fā) ETX 敏感的 SWD
2. AS的行為狀態(tài)依賴性誘導：
大鼠發(fā)作間期誘導失神發(fā)作（AS）的能力受覺醒狀態(tài)影響顯著：安靜清醒狀態(tài)（QW）下的誘導效果遠好于活動清醒狀態(tài)（AW），調(diào)整藍光刺激（LS）的脈沖時長，也未改變這種依賴覺醒狀態(tài)的誘導差異。而在慢波睡眠狀態(tài)（SWS）下，無論如何調(diào)整 LS 的脈沖時長與強度，都無法誘導出 AS。
此外，對非癲癇對照的 NEC 大鼠而言，無論處于哪種行為狀態(tài)，向其 VB 丘腦皮層（TC）神經(jīng)元施加單次或重復的 LS 脈沖，都不能誘導出棘慢波放電（SWD）或行為停止，說明該品系對自發(fā)性及 LS 誘導的 AS 天然耐藥。
雖有部分 Wistar 大鼠會出現(xiàn)自發(fā) AS，但在無自發(fā) AS 的 “正常” Wistar 大鼠中，僅在 QW 期間對其 VB TC 神經(jīng)元施加 LS 可可靠誘導 AS，AW 和 SWS 期間誘導效果差；且這種誘導出的 AS，頻率與 GAERS 大鼠的自發(fā) AS 一致，但持續(xù)時間更短。
圖3 GAERS 和 Wistar 大鼠 SWD 誘導的行為狀態(tài)依賴性
3.AS板塊：
在明確發(fā)作間期對丘腦皮層（TC）神經(jīng)元施加藍光刺激（LS）可引發(fā)失神發(fā)作（AS）后，研究進一步探究了該刺激阻斷 AS 的能力。結(jié)果顯示，假刺激對阻斷 AS 無效，而對 GAERS 大鼠 VB TC 神經(jīng)元施加單個短脈沖 LS，就能阻斷絕大多數(shù)棘慢波放電（SWD）及相關(guān)行為停滯，刺激后大鼠會立即恢復活動，表明 AS 已被阻斷；延長 LS 脈沖持續(xù)時間，AS 阻斷效果還會進一步提升。
為了解 LS 中斷癲癇發(fā)作的效果是否與刺激時機相關(guān)，研究對比了在 SWD 早期與晚期施加 LS 的情況，發(fā)現(xiàn)兩個階段的 LS 都能終止癲癇發(fā)作，且效果差異無統(tǒng)計學意義，說明丘腦刺激在 SWD 開始時及后期更發(fā)達階段均能破壞 SWD。
值得注意的是，在細胞層面，SWD 被阻斷時，丘腦多單元活動（MUA）總會從節(jié)律性放電轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則放電；LS 作用后，部分 AS 會被立即阻斷，還有部分會在后續(xù) SWD 周期內(nèi)被阻斷。即便有些 AS 未被 LS 阻斷，其 SWD 功率也低于接受假刺激的癲癇發(fā)作，且 LS 阻斷癲癇發(fā)作的效果與施加時所處的 SWD 周期階段無關(guān)。
圖4 VB TC 神經(jīng)元的選擇性 LS 阻斷了 GAERS 中正在進行的 SWD
研究結(jié)論：
移動 GAERS 大鼠的自發(fā)性失神發(fā)作（AS），發(fā)作間期直接藍光刺激（LS）誘發(fā)的去極化則能引發(fā)類似自發(fā)性 AS 的發(fā)作；二是 AS 在安靜清醒狀態(tài)（QW）下更易被 LS 誘發(fā)，活動清醒狀態(tài)（AW）次之，慢波睡眠（SWS）中無誘發(fā)，且 QW 期間 VB TC 神經(jīng)元短暫 LS 可在自由移動 Wistar 大鼠中低概率誘發(fā) AS，卻無法在 NEC 大鼠中誘發(fā)。
研究還發(fā)現(xiàn)，ChR2 轉(zhuǎn)染 TC 神經(jīng)元的 LS 可使其直接去極化，單個短暫光遺傳學脈沖產(chǎn)生的強直放電對誘發(fā)或終止 AS 的效果，僅取決于在發(fā)作間期或發(fā)作時遞送，即 QW 期間 TC 神經(jīng)元去極化可使丘腦皮質(zhì)（CTC）網(wǎng)絡(luò)在正常功能與 AS 病理活動間切換。且 TC 神經(jīng)元選擇性刺激消除 AS 與 SWD 階段無關(guān)，這與體感 CTC 網(wǎng)絡(luò)在 AS 模型中生成 SWD 的已知作用不同，VB TC 神經(jīng)元兼具生成與終止 SWD 的雙重功能屬新發(fā)現(xiàn)。
此外，QW 期間特異性刺激 VB TC 神經(jīng)元是喚起 AS 的最有效方式，這與該狀態(tài)下皮質(zhì)和丘腦神經(jīng)元易發(fā)生低頻振蕩相關(guān)；AW 期間刺激效果差、SWS 期間無誘發(fā)，也與不同狀態(tài)下神經(jīng)元特性及振蕩情況一致。同時，研究對丘腦 T 型鈣通道在 AS 生成中的作用提出探討，結(jié)合實驗結(jié)果及過往研究，認為 TC 神經(jīng)元爆發(fā)放電并非 SWD 產(chǎn)生的必需條件，QW 期間腦電圖微狀態(tài)動態(tài)與皮質(zhì)組裝活動的協(xié)調(diào)，或可解釋該狀態(tài)下 LS 觸發(fā) SWD 更有效的原因，為 AS 產(chǎn)生無需 TC 神經(jīng)元低閾值尖峰提供了額外證據(jù)。
參考文獻：
Morais TP, Taylor HL, Nagy O, Mátyás F, David F, Crunelli V, Lőrincz ML. Bidirectional control of generalized absence epilepsy networks via real-time direct depolarization of thalamocortical neurons. Prog Neurobiol. 2025 Jun 4;252:102774. doi: 10.1016/j.pneurobio.2025.102774. Epub ahead of print. PMID: 40339636.
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