表觀遺傳學(xué)的工作原理及HiFi測序技術(shù)助力改變這一研究領(lǐng)域

表觀遺傳學(xué)主要研究基因活性如何在不改變 DNA 序列本身的情況下發(fā)生變化�？梢园阉�想象成基因的 “音量控制”，根據(jù)環(huán)境和細(xì)胞信號來調(diào)高或調(diào)低基因的表達(dá)。這些調(diào)節(jié)是由 DNA 甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和非編碼 RNA 活性等機(jī)制驅(qū)動的。表觀遺傳學(xué)在細(xì)胞功能中起著至關(guān)重要的作用，并且會影響從個體發(fā)育到疾病等各個方面，尤其是在癌癥等病癥中¹。下面讓我們深入探討表觀遺傳學(xué)的工作原理，以及 HiFi 測序技術(shù)是如何改變這一研究領(lǐng)域的。

 
理解 DNA 甲基化

DNA 甲基化是指在 DNA 的四種核苷酸堿基之一上添加一個甲基基團(tuán)²，本質(zhì)上是為特定功能標(biāo)記 DNA 。在最常見的一種甲基化類型中，甲基基團(tuán)附著在胞嘧啶堿基的第 5 個碳原子上，這被稱為 5mC 甲基化³。甲基化對人類發(fā)育至關(guān)重要，并且會受到飲食或壓力等環(huán)境因素的影響。當(dāng)出現(xiàn)異常情況，比如異常的甲基化模式，就可能導(dǎo)致疾病，如癌癥，在癌癥中抑癌基因可能會因此被關(guān)閉⁴。

亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法可將甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閴A基變化，一直以來被用于通過測序或微陣列研究甲基化，但這種方法會降解 DNA，難以全面了解甲基化情況。PacBio HiFi 測序技術(shù)則不同，它在每次測序運(yùn)行中都能自動提供更準(zhǔn)確、更全面的甲基化信息，無需進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理或額外的文庫制備方法⁵，使研究人員能夠輕松地將甲基化研究成果融入對表觀遺傳調(diào)控更廣泛的理解之中。

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)：表觀遺傳學(xué)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)涵蓋了 DNA 緊密包裝進(jìn)入細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)組織方式。染色質(zhì)纖維是由 DNA 長鏈纏繞在稱為組蛋白的蛋白質(zhì)上形成的。這些結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成了類似串珠的核小體，在包裝 DNA 和調(diào)節(jié)其可及性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這種動態(tài)結(jié)構(gòu)通過控制特定 DNA 片段是處于可轉(zhuǎn)錄的開放狀態(tài)，還是緊密包裝無法接觸的狀態(tài)，來影響基因的表達(dá)。

一種具有開創(chuàng)性的方法 ——Fiber-seq，它利用 HiFi 測序來識別染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括沿著每條測序讀長確定核小體、轉(zhuǎn)錄因子的位置以及可及染色質(zhì)區(qū)域 ⁶。通過研究染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，研究人員能夠了解 DNA 和相關(guān)蛋白質(zhì)的空間排列如何影響基因調(diào)控。

表觀遺傳學(xué)研究的新時代

在之前的一篇微信文章中，我們介紹了由華盛頓大學(xué)的 Andrew Stergachis 博士和 Mitchell Vollger 博士領(lǐng)導(dǎo)的一項研究成果，即把 Fiber-seq 與甲基化組測序相結(jié)合，同時在單個 Revio SMRT Cell 上對基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序的強(qiáng)大功能。今年1月這項研究正式在《自然遺傳學(xué)》雜志上發(fā)表，值得關(guān)注。這項具有里程碑意義的研究成果的重要性值得再次強(qiáng)調(diào)：通過在單次測序運(yùn)行中整合四種高質(zhì)量、單倍型解析的 “組學(xué)”—— 基因組、CpG 甲基化組、染色質(zhì)表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組，該方法能夠快速解析不明罕見疾病的潛在機(jī)制。這一成果展示了 PacBio 技術(shù)在提供基因調(diào)控整體視圖方面的潛力，為深入了解復(fù)雜的生物學(xué)過程提供了非凡的見解。該研究強(qiáng)調(diào)了整合這些層面的信息如何能加深我們對疾病的理解，進(jìn)而推動更有效的診斷和治療方法的發(fā)展。

 
探索復(fù)雜的表觀遺傳景觀

除了 DNA 甲基化和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)外，還有多種其他機(jī)制參與基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。非編碼 RNA（ncRNAs），包括微小 RNA（miRNAs）和長鏈非編碼 RNA（lncRNAs），在微調(diào)基因活性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，miRNAs 通常通過與信使 RNA（mRNAs）結(jié)合，阻止它們翻譯成蛋白質(zhì)。而 lncRNAs 則可以通過與染色質(zhì)相互作用，或引導(dǎo)調(diào)控蛋白到達(dá)特定的基因組區(qū)域，來影響基因表達(dá)。這些 ncRNAs 已成為發(fā)育、分化和疾病等過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

此外，RNA 修飾過程 —— 在轉(zhuǎn)錄后改變 RNA 序列，為基因調(diào)控增添了另一層復(fù)雜性。這種機(jī)制可以在不改變基礎(chǔ) DNA 序列的情況下影響基因的表達(dá)，為響應(yīng)環(huán)境或細(xì)胞信號提供了一種動態(tài)控制基因功能的方式。

這些多樣的機(jī)制使表觀遺傳景觀變得更加復(fù)雜，而高精度的 HiFi 長讀長測序技術(shù)能夠通過完整捕獲長序列，更清晰地描繪這些相互作用。

HiFi 測序：表觀基因組更全面的解決方案

PacBio HiFi 測序技術(shù)在單一平臺上實現(xiàn)了對 DNA、RNA 及其相關(guān)甲基化特征的高精度單分子水平分析，為表觀遺傳圖譜繪制提供了更全面的解決方案。該技術(shù)兼具 99.9% 的超高準(zhǔn)確性與 20 kb 及以上的讀長優(yōu)勢，其分析范圍可覆蓋其他技術(shù)難以觸及的基因組復(fù)雜區(qū)域（如重復(fù)序列區(qū)或結(jié)構(gòu)變異區(qū)）。與其他方法不同，HiFi 測序無需經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理或擴(kuò)增步驟，能直接捕獲天然分子，完整保留原始表觀遺傳標(biāo)記，因此非常適合對表觀基因組進(jìn)行精準(zhǔn)且全面的表征。這種簡化的實驗流程不僅節(jié)省時間，還能確保 DNA 完整性，使研究人員可在單次測序中捕獲多種甲基化特征。

Revio測序系統(tǒng)推出的SPRQ化學(xué)試劑，結(jié)合 SMRT Link 軟件及儀器固件的更新，大幅提升了 Revio 平臺的多組學(xué)分析能力。這包括優(yōu)化 DNA 甲基化檢測算法，將檢測范圍擴(kuò)展至 6mA 甲基化（可作為 Fiber-seq 技術(shù)中開放染色質(zhì)的標(biāo)志物），并提高了 5mC 甲基化的檢測準(zhǔn)確性。此外，該試劑還實現(xiàn)了 30% 的數(shù)據(jù)產(chǎn)出提升，使研究人員能夠在 PacBio 平臺上同時捕獲表觀基因組的多個維度信息，推動表觀基因組研究向規(guī)模化、高通量方向變革。

跨領(lǐng)域的變革性影響

HiFi 測序技術(shù)在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的創(chuàng)新應(yīng)用，已在多個研究領(lǐng)域產(chǎn)生變革性影響：

• 癌癥研究：通過 HiFi 測序，研究人員在 COLO829 黑色素瘤細(xì)胞系中精準(zhǔn)定位了特定甲基化模式 —— 在 p53 調(diào)控的 DNA 復(fù)制抑制劑基因 KLLN 的上游區(qū)域檢測到高甲基化現(xiàn)象，為解析癌癥發(fā)生的表觀遺傳機(jī)制提供了關(guān)鍵線索⁷。
• 罕見病研究：異常甲基化模式與強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良等罕見病密切相關(guān)，也是致病性重復(fù)序列擴(kuò)張的重要影響因素（例如，F(xiàn)MR1 基因座的 CGG 重復(fù)序列擴(kuò)張會導(dǎo)致脆性 X 綜合征）。HiFi 測序憑借高準(zhǔn)確性、長讀長及甲基化檢測能力，成為表征這類重復(fù)序列擴(kuò)張的理想工具³。

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• 神經(jīng)科學(xué)研究：研究團(tuán)隊利用 HiFi 測序分析了阿姆斯特丹癡呆隊列中 92 名阿爾茨海默病患者與 117 名健康百歲老人的甲基化特征，在風(fēng)險單倍型 TMEM106B 的 3’非翻譯區(qū)（3’UTR）發(fā)現(xiàn)了一個 AluYb8 逆轉(zhuǎn)座子。進(jìn)一步的甲基化分析顯示，攜帶該 AluYb8 元件的 TMEM106B 單倍型甲基化水平顯著高于未攜帶該元件的單倍型，為神經(jīng)退行性疾病的表觀遺傳機(jī)制研究提供了新視角⁸。
• 微生物基因組研究：DNA甲基化堿基的同步檢測為微生物研究帶來了變革⁹，已被廣泛應(yīng)用于分析甲基化對微生物致病性¹⁰、免疫系統(tǒng)侵襲能力等方面的影響¹¹，推動了微生物表觀遺傳學(xué)的發(fā)展。