新冠病毒的背景及研究進展

新冠肺炎在數(shù)月蔓延全球，疫情的傳播程度和嚴重性令人深感擔憂。在繁忙的戰(zhàn)疫期間，中國展示了在全球公共衛(wèi)生事業(yè)上盡心盡力的大國擔當。國內(nèi)疫情正在退潮，國外困難卻越來越明顯的浮現(xiàn)出來。對此新冠肺炎病毒檢測以及治療藥物研究就越來越重要。全球科研機構(gòu)以及企業(yè)研發(fā)人員都積極投入到此次研究中來。

背景

冠狀病毒（Coronaviruses，CoV）屬于尼多病毒目冠狀病毒科，為有包膜的單股、正鏈RNA病毒，分為α，β和γ三個屬。冠狀病毒粒子呈球形或不規(guī)則形，有囊膜，大小為80-120 nm。其基因組的5'端帶有帽子結(jié)構(gòu)，其后包含6-10個開放閱讀框(Open reading frames，ORFs)。占據(jù)基因組2/3的第一個閱讀框編碼復制酶，基因組的另1/3主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白，一般包括纖突蛋白(spike，S)、小包膜蛋白(envelope，E)、囊膜蛋白(membrance，M)、核蛋白(nucleocapsid，N)。E蛋白和M蛋白主要參與病毒的裝配過程，N蛋白包裹基因組形成核蛋白復合體
  冠狀病毒主要通過刺突糖蛋白（Spike glycoprotein, S glycoprotein）與宿主細胞受體結(jié)合介導病毒的入侵并決定病毒組織或宿主嗜性。刺突糖蛋白（S蛋白）是一類很大的三聚體跨膜糖蛋白，其在病毒表面形成特殊的花冠結(jié)構(gòu)，冠狀病毒因此而得名。S蛋白可識別宿主細胞受體并介導膜融合，對于病毒顆粒進入細胞至關(guān)重要，是病毒感染宿主細胞的關(guān)鍵因子。SARS-CoV-2和2003年的SARS病毒一樣，都是通過識別人類宿主的ACE2蛋白從而進入細胞的，尤其是，S蛋白結(jié)構(gòu)域的細胞受體結(jié)合區(qū)（Receptor binding domain，RBD）直接參與了宿主受體的識別，該區(qū)域的氨基酸變異會導致病毒的種屬嗜性和感染特性的變化。因此，獲取SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2蛋白的復合物結(jié)構(gòu)，將有助于理解新冠病毒對比SARS病毒與ACE2結(jié)合的差異，以及SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2 結(jié)合時的存在狀態(tài)，因此，SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2蛋白的復合物結(jié)構(gòu)為進一步精確地疫苗設計以及抗病毒藥物的發(fā)現(xiàn)提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學基礎。

 

在新冠肺炎（COVID-19）疫情爆發(fā)之后沒多久，中國科學院上海巴斯德研究所和武漢病毒研究所的科學家就先后發(fā)現(xiàn)：新型冠狀病毒和SARS病毒一樣，也是通過利用S蛋白結(jié)合人體細胞表面的ACE2蛋白進入細胞的。

從那之后，新冠病毒的S蛋白和細胞表面的ACE2成為科學家們的研究重點。日前，美國德克薩斯大學奧斯汀分校Jason S. McLellan團隊和西湖大學周強實驗室先后利用冷凍電鏡技術(shù)分別首次成功解析了S蛋白（spike protein）和ACE2的完整結(jié)構(gòu)，以及完整ACE2蛋白與新冠病毒S蛋白受體結(jié)構(gòu)域（RBD）的復合物結(jié)構(gòu)。

 

Jason S. McLellan 研究組中，研究人員獲得了處于預融合構(gòu)象的新型冠狀病毒突刺蛋白三聚體的冷凍電鏡（cryo-EM）結(jié)構(gòu)，其分辨率為 3.5Å。三聚體的主要狀態(tài)為三個受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）之一向上旋轉(zhuǎn)為受體可至構(gòu)象。

  生物物理和結(jié)構(gòu)證據(jù)表明，較之 SARS 冠狀病毒，新型冠狀病毒的三聚體更容易與細胞表面的 ACE2 蛋白結(jié)合。另外，研究者們也測試了幾個已經(jīng)發(fā)表過的 SARS 冠狀病毒 RBD 特異性單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)它們與新冠病毒 S 突刺蛋白沒有明顯的結(jié)合，這表明兩種病毒 RBD 之間的抗體交叉反應性可能受到限制。
 

預融合構(gòu)象中的 2019-nCoV S 蛋白結(jié)構(gòu)
 

 

而西湖大學周強團隊則借助于氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白B0AT1，成功在實驗室里獲得了穩(wěn)定的人細胞受體ACE2的結(jié)構(gòu)，并利用冷凍電鏡技術(shù)，解析了ACE2的完整三維結(jié)構(gòu)。

發(fā)現(xiàn)了ACE2是以二聚體的形式存在，同時具有開放和關(guān)閉兩種構(gòu)象，而且兩種構(gòu)象都有與冠狀病毒結(jié)合的界面。進一步研究發(fā)現(xiàn)，一個ACE2二聚體能結(jié)合兩個SARS冠狀病毒的S蛋白三聚體。

此外，還發(fā)現(xiàn)ACE2細胞外的那部分（PD）存在6個糖基化位點，這比之前的研究成果多出了4個。

兩個ACE2蛋白聚合在一起

 

為了揭示ACE2與新冠病毒之間的識別細節(jié)，他們獲取了新冠病毒S蛋白的RBD。發(fā)現(xiàn)這個RBD就是新冠病毒識別并結(jié)合細胞受體ACE2的關(guān)鍵。

有了S蛋白的RBD之后，他們將RBD與之前獲得的ACE2-B0AT1復合體，按照接近1：1的比例混合，讓它們自由結(jié)合。然后獲得復合物，用冷凍電鏡給它們拍照片。最后獲得了分辨率達2.9Å的RBD-ACE2-B0AT1復合體。

基于這個復合體，他們的第一個發(fā)現(xiàn)是：雖然ACE2二聚體有開放和關(guān)閉兩種構(gòu)象，而且都有與冠狀病毒結(jié)合的界面；但是與S蛋白RBD結(jié)合的ACE2-B0AT1復合體只有關(guān)閉構(gòu)象。

RBD-ACE2-B0AT1 復合物的冷凍電鏡密度圖，框內(nèi)為RBD（黃色）與ACE2（藍色）的相互作用界面
 

 

王新泉和張林琦團隊選擇在Hi5昆蟲細胞中表達新冠病毒S蛋白的RBD和人細胞受體ACE2細胞外部分。很顯然，這個研究的目的就是想看清楚新冠病毒S蛋白的RBD與ACE2的結(jié)合部分究竟長什么樣。

經(jīng)過一些列的表達和純化，得到了新冠病毒S蛋白的RBD（Cys336至Glu516殘基）和人細胞受體ACE2細胞外部分（Ser19至Asp615殘基）的晶體結(jié)構(gòu)，然后利用X射線衍射技術(shù)，最終獲得了分辨率達到2.5Å三維結(jié)構(gòu)圖。

他們發(fā)現(xiàn)新冠病毒S蛋白的RBD的18個氨基酸殘基，與人細胞受體ACE2細胞外部分的20個氨基酸殘基結(jié)合，結(jié)合面積在1700Ų左右。對于SARS病毒而言，是16個氨基酸對20個氨基酸。

與新冠病毒結(jié)合和SARS病毒結(jié)合的那20個ACE2的氨基酸殘基，有17個是一樣的。在新冠病毒RBD與ACE2的結(jié)合界面，有17個氫鍵和1個鹽橋；而SARS病毒和ACE2的結(jié)合界面，有12個氫鍵和2個鹽橋。

新冠病毒RBD與ACE2結(jié)合

 

這些研究從近原子水平的分辨率解析了新型冠狀病毒 S 蛋白，為進一步精確地疫苗設計以及抗病毒藥物的發(fā)現(xiàn)提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學基礎，為后續(xù)對抗新冠的疫苗和抗病毒藥物研發(fā)提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學數(shù)據(jù)支撐。

基于S蛋白及其與ACE2相互作用的治療策略已經(jīng)在眾多致力于解決這次全球性公共衛(wèi)生事件的制藥企業(yè)和科研院所中廣泛開展并取得了初步的進展。我們相信，隨著更多的研究和臨床試驗拼成一幅完整的拼圖，我們終將打贏這場防疫之戰(zhàn)。

針對新冠病毒，目前依然缺少蛋白類、抗體類的診斷和治療手段。對于新冠病毒的診斷研發(fā)，華安生物將以N蛋白和S蛋白為主要研發(fā)目標，而針對新冠病毒的抗體藥物治療手段，將以S蛋白和ACE2的中和抗體為研發(fā)目標。華安生物研發(fā)部已經(jīng)開發(fā)了SARS-CoV-2一系列蛋白及抗體，近期將會上市。

 

參考文獻：

[1].https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.19.956946v1

[2].https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.19.956235v1

[3].https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.28.923011v1

[4].https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.11.944462v1

[5].http://eprint.las.ac.cn/abs/202002.00004