養(yǎng)細胞中有小黑點，是碎片or污染，如何防范處理
養(yǎng)細胞中有小黑點，是碎片or污染？如何防范處理
相信很多養(yǎng)細胞的新手都遇到過，在養(yǎng)細胞中，細胞在顯微鏡下觀察小黑點，背景比較臟。遇到這樣的問題又不知道怎么去辨別細胞情況！�。�
如果在顯微鏡下觀察到了小黑點，基本上可以將范圍縮小到是細菌污染還是細胞碎片。到底是污染還是碎片，可從以下幾個方面進行判斷：
1、運動性：很多會動的小黑點，只是發(fā)生布朗運動的細胞碎片。從運動性上比較，浮躁的細菌活躍的多。
2、培養(yǎng)基的渾濁度：如果在顯微鏡下無法辨認，那就交給時間吧。細胞培養(yǎng)基對于細菌來說是非常營養(yǎng)的大餐。一旦發(fā)生污染，細菌就會大量繁殖。培養(yǎng)基PH值迅速下降，培養(yǎng)基變黃且會變渾濁。通常在12小時內就可以發(fā)現(xiàn)，而在48小時內就非常明顯。被污染的細胞培養(yǎng)基變黃且渾濁、未被污染的細胞培養(yǎng)基偏紅且澄清。
3、接種平板：將懷疑污染物接種在微生物培養(yǎng)平板中，觀察菌落形成情況。碎片？細菌？一目了然。
對于養(yǎng)細胞的小伙伴，污染是避之唯恐不及，防范于未然更重要。
哪些步驟最容易發(fā)生污染？
最容易導致細菌污染的一個步驟就是細胞在水浴鍋解凍后沒有徹底消毒。如果這個步驟發(fā)生污染的話，細胞接種24小時之內就會明顯觀察到細胞污染。另外幾個可能導致污染的操作是：放培養(yǎng)基的瓶子或者管子在用水浴鍋預熱后，沒有徹底消毒。實驗員在操作過程中槍頭有可能接觸到被污染的部分而導致細胞污染。為了防止這種情況，容器外表面包括帽子應噴灑75%乙醇徹底消毒，然后用無菌棉墊擦干。
實驗員在操作過程中，移液器的槍尖可能會碰到超菌臺內壁或者超菌臺內放置的其他瓶子或設備，有時可能會碰到包含細胞的細胞培養(yǎng)瓶外表面，甚至會碰到手套，或者實驗操作服的袖口。以上所提到的任何一項操作失誤，都會導致細菌污染。
保持無菌工作區(qū)是防止細胞污染的最佳方式：
1、使用前和使用后，用75%乙醇對所有工作表面進行消毒。如果操作過程發(fā)生液體溢出的情況，這一項特別重要；
2、保持一個整潔的工作空間；工作區(qū)應該只包含必須的實驗設備；
3、在實驗之前確保已經準備好所有需要的試劑和耗材，避免反復進出操作區(qū)；
4、保證整個實驗操作在經過徹底消毒的超菌工作臺或者生物安全柜中進行。超凈工作臺或者生物安全柜可以通過紫外線和75%乙醇結合的方式消毒；
5、經常清潔用于細胞培養(yǎng)的水浴鍋，經常對細胞培養(yǎng)箱進行消毒。
細胞碎片應該怎么處理：
1、細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，折光屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變。
2、細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞已經分泌的分泌泡，可以先換液后用PBS潤洗清除，潤洗不能清除的可以消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
培養(yǎng)基污染應該怎么處理
1、在使用前和使用后，用75%乙醇對培養(yǎng)基和其他試劑瓶子的外表面進行消毒。此外，不要讓試劑瓶口敞開過長時間；
2、盡可能將培養(yǎng)基和其他需要的試劑分裝。如果在在操作過程中發(fā)生錯誤操作，最好不好再使用；
3、在操作培養(yǎng)基時，請使用一次性的塑料或者玻璃的無菌移液管。每個吸管只有一次，以避免交叉污染；
4、每天用顯微鏡觀察細胞，密切注意培養(yǎng)基的渾濁度；
5、避免和其他人共同使用培養(yǎng)基和其他試劑；
6、每個細胞系使用一瓶培養(yǎng)基。這樣可以有效避免交叉污染；
7、一次只操作一個細胞系，避免細胞之間的交叉污染；
細胞被污染了應該怎么處理：
1、細菌污染
1.1、細菌污染的細胞，培養(yǎng)基會明顯渾濁，靜置后會在底部形成一層沙狀物，顯微鏡下觀察細胞被細菌包圍死亡。
1.2、細菌污染檢測，可以取細胞培養(yǎng)上清1ml左右，接種到3ml LB培養(yǎng)基，搖菌過夜。若培養(yǎng)基明顯變渾濁，則證明細菌污染；若無明顯變色，證明無污染。
1.3、細菌污染的細胞處理后及時丟棄，不會對其他細胞造成影響。
1.4、細胞碎片應注意與細菌、真菌污染區(qū)分，主要區(qū)別在于細胞碎片不會明顯增殖，而細菌、真菌在過夜后即可明顯觀察到增殖，甚至完全遮蔽細胞。
1.5、細菌污染一般在污染源進入后1-2天即可爆發(fā)，故發(fā)現(xiàn)污染時可以自行溯源。
2、真菌污染
2.1、真菌污染的細胞，顯微鏡下可以明顯看到樹枝狀霉菌菌絲或其他形態(tài)的菌體，肉眼可以看到明顯白色斑點或者培養(yǎng)基內顆粒狀物質漂浮。
2.2、真菌無須檢測，顯微鏡及肉眼即可分辨。
2.3、真菌污染的細胞，處理后及時丟棄，同時需要對培養(yǎng)箱及操作臺進行消毒處理，避免污染其他細胞。
2.4、真菌污染一般在污染源進入2-4天內即可爆發(fā)，發(fā)現(xiàn)污染時可以自行溯源。
3、支原體污染
3.1、支原體污染在國內是普遍存在的問題，大部分實驗室缺乏檢測及控制支原體污染的方法，導致有很大比例的細胞含有支原體污染。
3.2、支原體檢測方式多種多樣，PCR、熒光法、培養(yǎng)法、試劑盒等，不同實驗方式檢測的靈敏度、特異性、針對的支原體類型都不太一樣，所以各種檢測方法檢出結果有時會有出入。即同一個樣本，有的方法檢出陽性，有的陰性，有的強有的弱。
3.3、支原體處理的，用6孔板培養(yǎng)，每天換液，細胞長滿就傳代丟棄部分，基本可以保證2-3周清除干凈。
相信很多養(yǎng)細胞的新手都遇到過，在養(yǎng)細胞中，細胞在顯微鏡下觀察小黑點，背景比較臟。遇到這樣的問題又不知道怎么去辨別細胞情況！�。�
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1、運動性：很多會動的小黑點，只是發(fā)生布朗運動的細胞碎片。從運動性上比較，浮躁的細菌活躍的多。
2、培養(yǎng)基的渾濁度：如果在顯微鏡下無法辨認，那就交給時間吧。細胞培養(yǎng)基對于細菌來說是非常營養(yǎng)的大餐。一旦發(fā)生污染，細菌就會大量繁殖。培養(yǎng)基PH值迅速下降，培養(yǎng)基變黃且會變渾濁。通常在12小時內就可以發(fā)現(xiàn)，而在48小時內就非常明顯。被污染的細胞培養(yǎng)基變黃且渾濁、未被污染的細胞培養(yǎng)基偏紅且澄清。
3、接種平板：將懷疑污染物接種在微生物培養(yǎng)平板中，觀察菌落形成情況。碎片？細菌？一目了然。
對于養(yǎng)細胞的小伙伴，污染是避之唯恐不及，防范于未然更重要。
哪些步驟最容易發(fā)生污染？
最容易導致細菌污染的一個步驟就是細胞在水浴鍋解凍后沒有徹底消毒。如果這個步驟發(fā)生污染的話，細胞接種24小時之內就會明顯觀察到細胞污染。另外幾個可能導致污染的操作是：放培養(yǎng)基的瓶子或者管子在用水浴鍋預熱后，沒有徹底消毒。實驗員在操作過程中槍頭有可能接觸到被污染的部分而導致細胞污染。為了防止這種情況，容器外表面包括帽子應噴灑75%乙醇徹底消毒，然后用無菌棉墊擦干。
實驗員在操作過程中，移液器的槍尖可能會碰到超菌臺內壁或者超菌臺內放置的其他瓶子或設備，有時可能會碰到包含細胞的細胞培養(yǎng)瓶外表面，甚至會碰到手套，或者實驗操作服的袖口。以上所提到的任何一項操作失誤，都會導致細菌污染。
保持無菌工作區(qū)是防止細胞污染的最佳方式：
1、使用前和使用后，用75%乙醇對所有工作表面進行消毒。如果操作過程發(fā)生液體溢出的情況，這一項特別重要；
2、保持一個整潔的工作空間；工作區(qū)應該只包含必須的實驗設備；
3、在實驗之前確保已經準備好所有需要的試劑和耗材，避免反復進出操作區(qū)；
4、保證整個實驗操作在經過徹底消毒的超菌工作臺或者生物安全柜中進行。超凈工作臺或者生物安全柜可以通過紫外線和75%乙醇結合的方式消毒；
5、經常清潔用于細胞培養(yǎng)的水浴鍋，經常對細胞培養(yǎng)箱進行消毒。
細胞碎片應該怎么處理：
1、細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，折光屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變。
2、細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞已經分泌的分泌泡，可以先換液后用PBS潤洗清除，潤洗不能清除的可以消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
培養(yǎng)基污染應該怎么處理
1、在使用前和使用后，用75%乙醇對培養(yǎng)基和其他試劑瓶子的外表面進行消毒。此外，不要讓試劑瓶口敞開過長時間；
2、盡可能將培養(yǎng)基和其他需要的試劑分裝。如果在在操作過程中發(fā)生錯誤操作，最好不好再使用；
3、在操作培養(yǎng)基時，請使用一次性的塑料或者玻璃的無菌移液管。每個吸管只有一次，以避免交叉污染；
4、每天用顯微鏡觀察細胞，密切注意培養(yǎng)基的渾濁度；
5、避免和其他人共同使用培養(yǎng)基和其他試劑；
6、每個細胞系使用一瓶培養(yǎng)基。這樣可以有效避免交叉污染；
7、一次只操作一個細胞系，避免細胞之間的交叉污染；
細胞被污染了應該怎么處理：
1、細菌污染
1.1、細菌污染的細胞，培養(yǎng)基會明顯渾濁，靜置后會在底部形成一層沙狀物，顯微鏡下觀察細胞被細菌包圍死亡。
1.2、細菌污染檢測，可以取細胞培養(yǎng)上清1ml左右，接種到3ml LB培養(yǎng)基，搖菌過夜。若培養(yǎng)基明顯變渾濁，則證明細菌污染；若無明顯變色，證明無污染。
1.3、細菌污染的細胞處理后及時丟棄，不會對其他細胞造成影響。
1.4、細胞碎片應注意與細菌、真菌污染區(qū)分，主要區(qū)別在于細胞碎片不會明顯增殖，而細菌、真菌在過夜后即可明顯觀察到增殖，甚至完全遮蔽細胞。
1.5、細菌污染一般在污染源進入后1-2天即可爆發(fā)，故發(fā)現(xiàn)污染時可以自行溯源。
2、真菌污染
2.1、真菌污染的細胞，顯微鏡下可以明顯看到樹枝狀霉菌菌絲或其他形態(tài)的菌體，肉眼可以看到明顯白色斑點或者培養(yǎng)基內顆粒狀物質漂浮。
2.2、真菌無須檢測，顯微鏡及肉眼即可分辨。
2.3、真菌污染的細胞，處理后及時丟棄，同時需要對培養(yǎng)箱及操作臺進行消毒處理，避免污染其他細胞。
2.4、真菌污染一般在污染源進入2-4天內即可爆發(fā)，發(fā)現(xiàn)污染時可以自行溯源。
3、支原體污染
3.1、支原體污染在國內是普遍存在的問題，大部分實驗室缺乏檢測及控制支原體污染的方法，導致有很大比例的細胞含有支原體污染。
3.2、支原體檢測方式多種多樣，PCR、熒光法、培養(yǎng)法、試劑盒等，不同實驗方式檢測的靈敏度、特異性、針對的支原體類型都不太一樣，所以各種檢測方法檢出結果有時會有出入。即同一個樣本，有的方法檢出陽性，有的陰性，有的強有的弱。
3.3、支原體處理的，用6孔板培養(yǎng)，每天換液，細胞長滿就傳代丟棄部分，基本可以保證2-3周清除干凈。
