文章分享：In vivo CAR-T中Ab-LNP抗體靶點(diǎn)的比較和選擇

本文來(lái)源于微信公眾： RNA星球   作者： 倍增的耀菌君

文獻(xiàn)題目：Rapid receptor internalization potentiates CD7-targeted lipid nanoparticles for efficient mRNA delivery to T cells and in vivo CAR T-cell engineering
發(fā)表期刊：bioRxiv（預(yù)印本）
發(fā)表時(shí)間：2025年1月26日
研究團(tuán)隊(duì)：美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)/Capstan創(chuàng)始人Hamideh Parhiz為通訊作者
主要研究結(jié)果：本研究通過(guò)系統(tǒng)比較靶向不同T細(xì)胞表面受體（CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD4/8）的抗體功能化脂質(zhì)納米顆粒（tLNP），發(fā)現(xiàn)靶向CD7的tLNP在將mRNA遞送至T細(xì)胞、進(jìn)而于體內(nèi)外高效生成功能性嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞方面表現(xiàn)最優(yōu)。其核心機(jī)制在于，決定tLNP遞送效率的關(guān)鍵因素是抗體-受體復(fù)合物的內(nèi)化能力，而非受體在細(xì)胞表面的豐度。這一內(nèi)化能力是每種受體固有的特性，為理性選擇最佳靶點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)高效的體內(nèi)CAR-T細(xì)胞工程提供了全新框架。

研究背景
利用mRNA-LNP技術(shù)在體內(nèi)直接生成CAR-T細(xì)胞，可規(guī)避體外制造流程，實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)、可控的CAR表達(dá)，從而簡(jiǎn)化工藝并降低長(zhǎng)期毒性。

然而，T細(xì)胞本身內(nèi)吞活性弱，難以有效攝取傳統(tǒng)LNP。靶向脂質(zhì)納米顆粒（tLNP）通過(guò)表面偶聯(lián)識(shí)別T細(xì)胞受體的抗體，可引導(dǎo)LNP與特定T細(xì)胞亞群結(jié)合并觸發(fā)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞，是實(shí)現(xiàn)體內(nèi)T細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵。盡管已有研究靶向CD4、CD5、CD8等不同受體，但何種靶點(diǎn)最優(yōu)、其效率差異背后的機(jī)制何在，尚不明確。解決這一問(wèn)題，對(duì)于設(shè)計(jì)最優(yōu)的tLNP平臺(tái)至關(guān)重要。

核心內(nèi)容詳解

一、靶點(diǎn)頭對(duì)頭比較：CD7脫穎而出
研究對(duì)象與方法：
研究首先在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下，系統(tǒng)比較了靶向CD2、CD4、CD5、CD7、CD8及CD4/8雙靶點(diǎn)的tLNPs。將編碼ZsGreen熒光報(bào)告蛋白的mRNA封裝入tLNP，用以定量評(píng)估遞送效率。用不同劑量的各種tLNP處理活化的人原代T細(xì)胞，24小時(shí)后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析ZsGreen陽(yáng)性細(xì)胞比例和平均熒光強(qiáng)度（MFI）。

研究結(jié)果：

• 轉(zhuǎn)染效率：在最高劑量（1 μg mRNA/10萬(wàn)細(xì)胞）下，靶向CD2、CD5和CD7的tLNPs均能高效轉(zhuǎn)染約80%的T細(xì)胞。而靶向CD4、CD4/8的tLNPs效率中等（~60%），靶向CD8的tLNP效率最低（僅17%）。
• 亞群特異性與廣度：CD2、CD5、CD7-tLNPs能同等高效地轉(zhuǎn)染CD4+和CD8+ T細(xì)胞。CD4-tLNP特異性轉(zhuǎn)染CD4+細(xì)胞，CD8-tLNP特異性轉(zhuǎn)染CD8+細(xì)胞，雙靶向tLNP雖能轉(zhuǎn)染兩者但效率較低。
• 蛋白表達(dá)強(qiáng)度：在高效轉(zhuǎn)染的tLNPs中，CD7-tLNP誘導(dǎo)的ZsGreen蛋白表達(dá)水平（MFI）最高，在CD4+和CD8+ T細(xì)胞中分別達(dá)25,583和23,131 A.U.，顯著高于CD5-tLNP和CD2-tLNP。

實(shí)驗(yàn)小結(jié)：在測(cè)試的所有靶點(diǎn)中，靶向CD7的tLNP綜合性能最佳，兼具高轉(zhuǎn)染效率、廣譜的T細(xì)胞亞群覆蓋以及最強(qiáng)的蛋白表達(dá)輸出。

二、機(jī)制探索：效率的關(guān)鍵在于“內(nèi)化”，而非“數(shù)量”
研究對(duì)象與方法：
為闡明上述效率差異的根源，研究者檢驗(yàn)了兩個(gè)假說(shuō)：
1）受體豐度決定效率；
2）抗體-受體復(fù)合物的內(nèi)化能力決定效率。他們通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)和流式細(xì)胞術(shù)分析了各受體在T細(xì)胞上的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
同時(shí)，利用IncuCyte FabFluor-pH抗體標(biāo)記系統(tǒng)（該標(biāo)記在酸性溶酶體環(huán)境中熒光增強(qiáng)）和活細(xì)胞成像，定量比較了不同抗體-受體復(fù)合物的內(nèi)化動(dòng)力學(xué)。此外，還將Cy5標(biāo)記的mRNA封裝入tLNP，通過(guò)共聚焦顯微鏡直接觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)mRNA的積累。

研究結(jié)果：

• 受體豐度并非決定因素：無(wú)論是轉(zhuǎn)錄組還是蛋白水平，CD2都是所測(cè)受體中表達(dá)量最高的，約為CD7的2-5倍。然而，CD2-tLNP產(chǎn)生的蛋白表達(dá)水平卻遠(yuǎn)低于CD7-tLNP，表明豐度無(wú)法解釋效率差異。
• 內(nèi)化能力與遞送效率強(qiáng)相關(guān)：活細(xì)胞成像顯示，CD7抗體的內(nèi)化速度最快、程度最高，其次是CD5抗體，而CD2抗體內(nèi)化很弱。這種內(nèi)化差異在多個(gè)不同克隆的CD7和CD2抗體間均穩(wěn)定存在，表明這是受體固有的特性。
• 內(nèi)化直接驅(qū)動(dòng)mRNA攝�。汗簿劢钩上耧@示，CD7-tLNP處理的細(xì)胞中，Cy5-mRNA的細(xì)胞內(nèi)積累最多，順序與抗體內(nèi)化能力完全一致（CD7 > CD5 > CD2）。定量分析證實(shí)，抗體內(nèi)化水平與細(xì)胞內(nèi)mRNA積累量呈極強(qiáng)正相關(guān)（r=0.894）。
• 翻譯狀態(tài)的潛在影響：細(xì)胞內(nèi)mRNA積累量與最終蛋白產(chǎn)量的相關(guān)性較弱（r=0.374）。RNA測(cè)序分析提示，CD7-tLNP處理的T細(xì)胞中，與mRNA代謝、翻譯和核糖體生物合成相關(guān)的通路更為活躍，表明靶向不同受體可能對(duì)細(xì)胞的翻譯活性有差異化調(diào)節(jié)。

實(shí)驗(yàn)小結(jié)：本研究揭示了tLNP遞送效率的一個(gè)全新核心原則：抗體-受體復(fù)合物的內(nèi)化能力是決定mRNA遞送效率的關(guān)鍵，且該能力是受體的固有屬性。 這解釋了為何表達(dá)量并非最高的CD7能成為最佳靶點(diǎn)。

三、復(fù)雜環(huán)境與體內(nèi)驗(yàn)證：CD7-tLNP表現(xiàn)穩(wěn)健
研究對(duì)象與方法：為了模擬體內(nèi)更真實(shí)的細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境，研究在人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs） 中評(píng)估了各tLNP的性能。隨后，在人源化小鼠模型（PBMC-NSG） 中，通過(guò)靜脈注射CD7-tLNP-ZsGreen，評(píng)估其體內(nèi)靶向遞送效率。

研究結(jié)果：

• 在PBMCs中：即使在與其他免疫細(xì)胞（如高內(nèi)吞活性的單核細(xì)胞）競(jìng)爭(zhēng)的情況下，CD7-tLNP依然在CD4+和CD8+ T細(xì)胞中保持了最高的轉(zhuǎn)染效率。值得注意的是，CD7在NK細(xì)胞上也有高表達(dá)，因此CD7-tLNP還能有效轉(zhuǎn)染約30%的NK細(xì)胞，這為同時(shí)工程化CAR-T和CAR-NK細(xì)胞提供了可能。
• 在體內(nèi)：給人源化小鼠注射CD7-tLNP-ZsGreen后24小時(shí)，在脾臟和血液的人源T細(xì)胞中均檢測(cè)到強(qiáng)烈的ZsGreen表達(dá)。其中，CD8+ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率和表達(dá)強(qiáng)度均高于CD4+ T細(xì)胞（脾臟中：88.7% vs 59.3% ZsGreen+），這與CD8+ T細(xì)胞表面CD7表達(dá)量更高相一致。

實(shí)驗(yàn)小結(jié)：CD7-tLNP不僅在純化的T細(xì)胞中有效，在模擬體內(nèi)的復(fù)雜細(xì)胞環(huán)境中以及真實(shí)的活體動(dòng)物模型內(nèi)，均能實(shí)現(xiàn)高效、特異性的mRNA遞送，展現(xiàn)了強(qiáng)大的轉(zhuǎn)化潛力。

四、功能驗(yàn)證：高效生成功能性抗CD20 CAR-T細(xì)胞
研究對(duì)象與方法：研究最終檢驗(yàn)了CD7-tLNP平臺(tái)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。將編碼抗CD20 CAR的mRNA封裝入CD7-tLNP，分別在體外和體內(nèi)生成CAR-T細(xì)胞，并評(píng)估其殺傷功能。

研究結(jié)果：

• 體外生成與殺傷：用CD7-tLNP-CAR處理人T細(xì)胞，可劑量依賴(lài)性地在CD4+和CD8+ T細(xì)胞中誘導(dǎo)高比例的CAR表達(dá)（最高劑量下可達(dá)48-76%）。這些體外生成的CAR-T細(xì)胞能有效殺傷CD20陽(yáng)性的Raji細(xì)胞，呈現(xiàn)效應(yīng)靶比依賴(lài)的細(xì)胞毒性。
• 體內(nèi)生成與清除：給人源化小鼠注射單劑CD7-tLNP-CAR（2.5 μg mRNA），24小時(shí)后即可在脾臟T細(xì)胞中檢測(cè)到顯著的CAR表達(dá)（CD4+平均33.3%，CD8+平均50.6%），效率顯著高于對(duì)照的CD2-tLNP-CAR。更重要的是，這些體內(nèi)原位生成的CAR-T細(xì)胞發(fā)揮了強(qiáng)大的功能，導(dǎo)致脾臟中CD20+ B細(xì)胞幾乎被完全清除（從約4-7%降至0.5%），免疫組化也顯示出強(qiáng)烈的Granzyme B表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)小結(jié)：CD7-tLNP平臺(tái)能夠在體內(nèi)外高效、快速地將治療性CAR mRNA遞送至T細(xì)胞，生成具有強(qiáng)大抗原特異性殺傷功能的CAR-T細(xì)胞，為基于mRNA的體內(nèi)細(xì)胞療法提供了強(qiáng)有力的工具。

小結(jié)
本研究通過(guò)系統(tǒng)性比較，確立了CD7作為體內(nèi)T細(xì)胞靶向mRNA遞送和CAR-T細(xì)胞工程的最優(yōu)受體。其突破性在于揭示了受體內(nèi)化能力是決定tLNP遞送效率的關(guān)鍵內(nèi)在機(jī)制，而非傳統(tǒng)認(rèn)為的受體豐度。這一“內(nèi)化能力優(yōu)先”的原則為未來(lái)理性設(shè)計(jì)與篩選靶向配體提供了核心框架。靶向CD7的tLNP平臺(tái)憑借其高效、廣譜、兼具T細(xì)胞和NK細(xì)胞靶向能力等優(yōu)勢(shì)，為開(kāi)發(fā)更簡(jiǎn)便、安全、普惠的“現(xiàn)貨型”體內(nèi)CAR-T/CAR-NK療法鋪平了道路，有望突破當(dāng)前細(xì)胞療法的制造與成本壁壘，應(yīng)用于癌癥、自身免疫病、纖維化等多種疾病領(lǐng)域。