蛋白質組學基礎：蛋白質糖基化修飾
糖蛋白質組學（Glycoproteomics）作為蛋白質組學的重要分支，聚焦于生物體內糖基化修飾蛋白的系統鑒定、定量分析及功能解析，是后基因組時代生命科學研究的前沿領域之一。糖基化作為最普遍且復雜的蛋白質翻譯后修飾，指在酶的催化下，單糖或寡糖鏈共價連接到蛋白質特定位點的過程，這層“糖衣”不僅塑造蛋白質的空間構象，更調控其生物活性、細胞定位與分子互作，貫穿胚胎發(fā)育、免疫應答、信號傳導等幾乎所有核心生命過程，要了解這些功能，就需要知道精確的聚糖結構，以及其結構變異性、與蛋白質的連接位點以及這些位點的占據程度等。
聚糖通常以糖蛋白或糖脂的形式存在于細胞上，它們分別與蛋白質或脂質共價結合。連接兩個單糖的鍵稱為糖苷鍵。聚糖主要通過兩種主要連接方式與蛋白質相連，一種是聚糖通過天冬酰胺的側鏈氮與蛋白質連接（N-連接聚糖），另一種是通過絲氨酸或蘇氨酸的側鏈氧連接（O-連接聚糖）。在N-連接糖基化的情況下，糖鏈一般與Asn-X-Thr/Ser（X是除脯氨酸外的任何氨基酸）基序的受體天冬酰胺結合。最常見的O-連接糖基化將單個單糖GalNAc（粘蛋白型糖基化）或GlcNAc（O-GlcNAc糖基化）與蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸結合，沒有比較固定的連接基序，并且在GalNAc的情況下，這種單糖會進一步延伸以形成各種核心聚糖結構。
圖1 哺乳動物中常見的蛋白質糖基化類型（Ieva Bagdonaite, et al., 2022）
對于聚糖的全面分析主要分為兩個層次，第一個層次是僅對單個聚糖結構及其異構模式的詳細分析，即糖組學，需要將聚糖從糖蛋白上釋放出來，釋放的聚糖可以進入質譜分析，也可以結合其他衍生化和分析技術，如熒光標記、全甲基化等，進行深入的結構表征。但由于聚糖已經不再結合蛋白質，所以無法研究特定于位點的信息。第二個層次是直接對糖蛋白上糖基化肽段、位點及糖型的表征，即糖蛋白質組學，保留聚糖-多肽的完整結合（圖1）。從復雜生物樣本中測定糖、糖肽及糖鏈的結構，可以借助核磁共振(NMR)、電噴霧電離質譜(ESI-MS)、基質輔助激光解吸電離質譜(MALDI-MS)和毛細管電泳(CE)等多種不同的技術，而目前LC-MS/MS是糖組學和糖蛋白質組學研究最常用的方法。
圖2 糖組學和糖蛋白質組學分析流程（Asif Shajahan, et al., 2017）
糖組學分析
在糖組學分析中，使用N-聚糖切割酶從肽的天冬酰胺殘基上切割，釋放出的具有親水性的N-聚糖，可以使用C18固相萃取(SPE)柱等與O-連接的糖肽和非糖基化肽分離。隨后，O-連接的糖肽和非糖基化肽從C18 SPE中洗脫。由于缺乏對O-連接聚糖具有廣泛特異性的去糖基化酶，因此O-連接聚糖的釋放通常通過化學方法完成。用于釋放O-聚糖的常見化學方法包括還原性β-消除、基于氨的非還原性β-消除或肼解。為了實現高靈敏度檢測，O-連接和N-連接的聚糖組分在質譜分析前通常會進行衍生化，如全甲基化、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基吡啶(2-AP)、4-氨基苯甲酸或鄰氨基苯甲酸等進行還原端標記。衍生化（特別是全甲基化）可增強游離聚糖的離子化效率，通過糖苷鍵斷裂和跨環(huán)斷裂，能夠從串聯質譜（MS/MS）譜圖中提取更詳細的結構信息。
圖3 全甲基化可區(qū)分聚糖同分異構（Asif Shajahan, et al., 2017）
糖蛋白質組學分析
由于糖基化修飾蛋白在生物樣本中占比極低，糖肽僅占總肽段的5%以下，且易被大量高豐度非糖肽掩蓋，直接進行質譜分析難以實現精準鑒定，因此需先通過富集技術特異性捕獲糖肽，再結合質譜分析解析其詳細信息。常用的富集技術各有側重，其中凝集素親和層析憑借凝集素與特定糖鏈結構的特異性識別能力，可針對性富集含對應糖鏈的糖肽，且操作簡便、兼容性強；親水相互作用色譜則基于糖肽與非糖肽的親疏水性差異，利用親水固定相將親水性更強的糖肽保留并分離，尤其適合富集弱酸性糖肽和短鏈糖肽，兩種技術可結合使用以提升富集效率與覆蓋面。其他方法包括免疫親和色譜法、酰肼法、硼酸法、二氧化鈦富集法等。
圖4 NEB凝集素親和N-糖肽結合蛋白
質譜：糖組學和糖蛋白質組學研究的關鍵技術
質譜分析作為糖組學和糖蛋白質組學解析的核心環(huán)節(jié)，分析流程主要包括樣本預處理→富集（糖/糖肽）→離子化→質譜分離與碎裂→譜圖解析（圖5）：
蛋白質糖基化研究的意義
1. 揭示生命基本規(guī)律
結語
糖組學與糖蛋白質組學正借助質譜技術，逐步揭示糖類分子在生命過程中的核心作用。從基礎科研到臨床應用，這一領域不僅拓展了我們對生命本質的認識，更為疾病診斷、藥物研發(fā)提供了新的可能性。未來，隨著質譜技術的不斷升級和人工智能的引入，糖組學研究將迎來更廣闊的應用前景。我們的PEAKS GlycanFinder軟件可以提供糖組學和糖蛋白質組學質譜數據的準確、全面的定性、定量分析結果，可以聯系我們深入交流，包括但不限于數據分析、實驗方案設計等。
參考文獻
作為生物信息學的領軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質組學和生物藥領域，通過機器學習和先進算法提供世界領先的質譜數據分析軟件和蛋白質組學服務解決方案，以推進生物學研究和藥物發(fā)現。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質組學、基因組學和醫(yī)學的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數千家學術和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現服務和抗體綜合表征服務等。
聯系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
聚糖通常以糖蛋白或糖脂的形式存在于細胞上，它們分別與蛋白質或脂質共價結合。連接兩個單糖的鍵稱為糖苷鍵。聚糖主要通過兩種主要連接方式與蛋白質相連，一種是聚糖通過天冬酰胺的側鏈氮與蛋白質連接（N-連接聚糖），另一種是通過絲氨酸或蘇氨酸的側鏈氧連接（O-連接聚糖）。在N-連接糖基化的情況下，糖鏈一般與Asn-X-Thr/Ser（X是除脯氨酸外的任何氨基酸）基序的受體天冬酰胺結合。最常見的O-連接糖基化將單個單糖GalNAc（粘蛋白型糖基化）或GlcNAc（O-GlcNAc糖基化）與蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸結合，沒有比較固定的連接基序，并且在GalNAc的情況下，這種單糖會進一步延伸以形成各種核心聚糖結構。
圖1 哺乳動物中常見的蛋白質糖基化類型（Ieva Bagdonaite, et al., 2022）對于聚糖的全面分析主要分為兩個層次，第一個層次是僅對單個聚糖結構及其異構模式的詳細分析，即糖組學，需要將聚糖從糖蛋白上釋放出來，釋放的聚糖可以進入質譜分析，也可以結合其他衍生化和分析技術，如熒光標記、全甲基化等，進行深入的結構表征。但由于聚糖已經不再結合蛋白質，所以無法研究特定于位點的信息。第二個層次是直接對糖蛋白上糖基化肽段、位點及糖型的表征，即糖蛋白質組學，保留聚糖-多肽的完整結合（圖1）。從復雜生物樣本中測定糖、糖肽及糖鏈的結構，可以借助核磁共振(NMR)、電噴霧電離質譜(ESI-MS)、基質輔助激光解吸電離質譜(MALDI-MS)和毛細管電泳(CE)等多種不同的技術，而目前LC-MS/MS是糖組學和糖蛋白質組學研究最常用的方法。
圖2 糖組學和糖蛋白質組學分析流程（Asif Shajahan, et al., 2017）
糖組學分析
在糖組學分析中，使用N-聚糖切割酶從肽的天冬酰胺殘基上切割，釋放出的具有親水性的N-聚糖，可以使用C18固相萃取(SPE)柱等與O-連接的糖肽和非糖基化肽分離。隨后，O-連接的糖肽和非糖基化肽從C18 SPE中洗脫。由于缺乏對O-連接聚糖具有廣泛特異性的去糖基化酶，因此O-連接聚糖的釋放通常通過化學方法完成。用于釋放O-聚糖的常見化學方法包括還原性β-消除、基于氨的非還原性β-消除或肼解。為了實現高靈敏度檢測，O-連接和N-連接的聚糖組分在質譜分析前通常會進行衍生化，如全甲基化、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基吡啶(2-AP)、4-氨基苯甲酸或鄰氨基苯甲酸等進行還原端標記。衍生化（特別是全甲基化）可增強游離聚糖的離子化效率，通過糖苷鍵斷裂和跨環(huán)斷裂，能夠從串聯質譜（MS/MS）譜圖中提取更詳細的結構信息。
圖3 全甲基化可區(qū)分聚糖同分異構（Asif Shajahan, et al., 2017）糖蛋白質組學分析
由于糖基化修飾蛋白在生物樣本中占比極低，糖肽僅占總肽段的5%以下，且易被大量高豐度非糖肽掩蓋，直接進行質譜分析難以實現精準鑒定，因此需先通過富集技術特異性捕獲糖肽，再結合質譜分析解析其詳細信息。常用的富集技術各有側重，其中凝集素親和層析憑借凝集素與特定糖鏈結構的特異性識別能力，可針對性富集含對應糖鏈的糖肽，且操作簡便、兼容性強；親水相互作用色譜則基于糖肽與非糖肽的親疏水性差異，利用親水固定相將親水性更強的糖肽保留并分離，尤其適合富集弱酸性糖肽和短鏈糖肽，兩種技術可結合使用以提升富集效率與覆蓋面。其他方法包括免疫親和色譜法、酰肼法、硼酸法、二氧化鈦富集法等。
圖4 NEB凝集素親和N-糖肽結合蛋白
質譜：糖組學和糖蛋白質組學研究的關鍵技術
質譜分析作為糖組學和糖蛋白質組學解析的核心環(huán)節(jié)，分析流程主要包括樣本預處理→富集（糖/糖肽）→離子化→質譜分離與碎裂→譜圖解析（圖5）：
1. 樣本預處理
先對生物樣本（組織、體液等）進行蛋白提取、酶解（糖蛋白質組學側重糖肽釋放，糖組學側重游離糖鏈/糖綴合物解離），去除雜質干擾。
2. 特異性富集
糖蛋白質組學需采用合適的方法特異性捕獲糖肽（排除非糖肽干擾）；糖組學可通過對應富集手段分離純化糖鏈，提升檢測靈敏度。
3. 離子化
采用適配糖/糖肽特性的電離方式，常用電噴霧電離（ESI）與液相色譜聯用，適配復雜混合物、微量樣本。
4. 質譜分離與碎裂
帶電離子進入質譜儀后，經質量分析器（飛行時間、軌道阱等）按質荷比分離；再通過單一或組合碎裂模式（碰撞誘導解離、電子轉移解離等）將母離子碎裂，采集相應的MS1和MS2譜圖信息。
5. 譜圖解析
結合專用軟件，匹配糖庫、肽段序列數據庫，實現精準解析（糖蛋白質組學需鑒定糖蛋白、糖基化位點及糖鏈結構，糖組學側重糖鏈精細結構解析）；可結合報告離子標記（TMT/iTRAQ）、非標定量（Label-free）等技術，完成不同狀態(tài)下目標物的差異定量，為功能研究提供依據，以及PRM技術靶向驗證目標糖肽。以上分析均可在PEAKS Glycanfinder中完成。
圖5 基于質譜的糖蛋白質組學（a）和糖組學（b）流程
蛋白質糖基化研究的意義
1. 揭示生命基本規(guī)律
- 糖基化廣泛參與細胞識別、信號傳導、細胞黏附、免疫識別、胚胎發(fā)育等核心生命過程。
- 糖鏈結構的多樣性與時空特異性，賦予蛋白質精細的功能調控能力，是生命復雜性的重要分子基礎。
- 與核酸、蛋白質共同構成生命信息傳遞的 “第三條分子鏈”，完善對生命本質的認知。
- 許多重大疾病的發(fā)生、發(fā)展都伴隨異常糖基化，如腫瘤、炎癥、神經退行性疾病、代謝疾病等。
- 糖基化異�？捎绊懙鞍追�(wěn)定性、定位、互作，直接參與細胞癌變、侵襲轉移、免疫逃逸等過程。
- 為從分子層面解釋疾病機制提供了傳統蛋白組學無法覆蓋的新維度。
- 糖基化修飾靈敏度高、變化早，是理想的疾病標志物來源。
- 典型如AFP-L3（肝癌特異性糖基化異質體），已成為臨床早期診斷與良惡性鑒別重要指標。
- 基于糖基化譜可實現更精細的疾病分型、預后判斷、療效監(jiān)測，推動精準醫(yī)學。
- 抗體、激素、疫苗等重組蛋白藥物的療效、半衰期、免疫原性高度依賴糖基化。
- 糖基化優(yōu)化是生物藥質量控制與藥效提升的關鍵環(huán)節(jié)。
- 為靶向藥物設計、抗感染疫苗、抗腫瘤療法提供全新靶點與策略。
- 糖基化連接基因組、蛋白質組與表型組，填補了從基因到功能的關鍵缺口。
- 糖組學、糖蛋白質組學的發(fā)展，讓生命科學從線性信息走向多維、動態(tài)、網絡化的系統研究。
結語
糖組學與糖蛋白質組學正借助質譜技術，逐步揭示糖類分子在生命過程中的核心作用。從基礎科研到臨床應用，這一領域不僅拓展了我們對生命本質的認識，更為疾病診斷、藥物研發(fā)提供了新的可能性。未來，隨著質譜技術的不斷升級和人工智能的引入，糖組學研究將迎來更廣闊的應用前景。我們的PEAKS GlycanFinder軟件可以提供糖組學和糖蛋白質組學質譜數據的準確、全面的定性、定量分析結果，可以聯系我們深入交流，包括但不限于數據分析、實驗方案設計等。
參考文獻
- Shajahan A, Heiss C, Ishihara M, Azadi P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 2017 Jul;409(19):4483-4505. doi: 10.1007/s00216-017-0406-7. Epub 2017 Jun 6. PMID: 28585084; PMCID: PMC5498624.
- Bagdonaite, I., Malaker, S.A., Polasky, D.A. et al. Glycoproteomics. Nat Rev Methods Primers 2, 48 (2022). https://doi.org/10.1038/s43586-022-00128-4
作為生物信息學的領軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質組學和生物藥領域，通過機器學習和先進算法提供世界領先的質譜數據分析軟件和蛋白質組學服務解決方案，以推進生物學研究和藥物發(fā)現。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質組學、基因組學和醫(yī)學的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數千家學術和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現服務和抗體綜合表征服務等。
聯系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
