標簽蛋白親和層析的分類、特性及選擇策略與實驗步驟
標簽蛋白親和層析是生物研究中核心的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，其本質(zhì)是通過在目標蛋白的 N 端或 C 端融合一段具有特定理化性質(zhì)的多肽（即 “標簽”），利用標簽與特定配體之間的特異性相互作用，實現(xiàn)目標蛋白的高效分離與富集。
標簽蛋白親和層析具有特異性強、操作簡便、純化效率高、回收率高且能保持蛋白活性等顯著優(yōu)勢，已成為重組蛋白表達后分離純化的首選技術(shù)，經(jīng)常用于標簽蛋白純化的第一步。
標簽蛋白親和層析基于生物分子間的特異性識別與結(jié)合的原理：融合標簽的目標蛋白通過層析柱時，標簽與層析柱上的配體發(fā)生特異性相互作用而被吸附，雜蛋白則因不具有標簽直接流出；隨后通過改變洗脫條件（如調(diào)節(jié) pH 值、離子強度或加入競爭性配體），使目標蛋白與配體解離，從而獲得高純度的重組蛋白。
一、常用標簽的分類及特性介紹
1、His 標簽（組氨酸標簽）
His 標簽是最常用的親和標簽之一，通常由 6-10 個連續(xù)的組氨酸殘基組成（以 6×His 標簽最為常見）。其核心作用機制是組氨酸殘基中的咪唑環(huán)能與鎳離子（Ni²⁺）、鈷離子（Co²⁺）等過渡金屬離子發(fā)生特異性螯合作用，從而實現(xiàn)目標蛋白的吸附與純化。
- 優(yōu)勢：
分子量�。�6×His 約 0.8 kDa），對目標蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及細胞定位影響極小，通常不需要切除；
可在天然或變性條件下進行，可直接用于包涵體柱上復(fù)性和純化；
免疫原性較低；
- 缺點：特異性相對較弱，部分富含組氨酸的雜蛋白可能會發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致純化產(chǎn)物純度下降，可通過優(yōu)化洗脫條件（如梯度咪唑洗脫）改善。
2、GST 標簽（谷胱甘肽 S - 轉(zhuǎn)移酶標簽）
GST 標簽是一種分子量較大的融合標簽（約 26 kDa），來源于大腸桿菌的谷胱甘肽 S - 轉(zhuǎn)移酶。其純化原理是 GST 能與固定在層析介質(zhì)上的谷胱甘肽（GSH）發(fā)生特異性結(jié)合，通過谷胱甘肽洗脫可獲得目標蛋白。
- 優(yōu)勢：
結(jié)合特異性高，純化產(chǎn)物純度通常較高；
具有促進蛋白折疊的作用，可提高重組蛋白的可溶性，尤其適用于表達易形成包涵體的蛋白；
純化條件溫和，能最大程度保持蛋白活性；
- 缺點：
分子量較大，可能會影響目標蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，尤其對小分子蛋白的影響更為顯著；純化后可通過腸激酶（貨號：UA070095），凝血酶（貨號：27084601），rTEV酶（貨號：UA070003），HRV 3C酶（貨號：UA070044）等切除標簽。
3、MBP 標簽（麥芽糖結(jié)合蛋白標簽）
MBP 標簽來源于大腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白，分子量約 42 kDa，其純化原理是 MBP 能與固定化的麥芽糖或直鏈淀粉發(fā)生特異性結(jié)合，通過麥芽糖洗脫實現(xiàn)純化。
- 優(yōu)勢：
具有極強的促可溶性作用，遠優(yōu)于 GST 標簽，是表達難溶性蛋白的首選標簽之一；
結(jié)合特異性高，純化產(chǎn)物純度高；
純化條件溫和，能最大程度保持蛋白活性；
- 缺點：
分子量較大，可能會影響目標蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，尤其對小分子蛋白的影響更為顯著；純化后可通過腸激酶（貨號：UA070095），凝血酶（貨號：27084601），rTEV酶（貨號：UA070003），HRV 3C酶（貨號：UA070044）等切除標簽。
4、Strep 標簽（鏈霉親和素結(jié)合標簽）
Strep 標簽是一類短肽標簽，常用的 Strep II 標簽由 8 個氨基酸殘基組成（WSHPQFEK），分子量約 1 kDa。其純化原理是 Strep 標簽?zāi)芘c鏈霉親和素的改造體（Strep-Tactin）發(fā)生特異性結(jié)合，通過生物素或脫硫生物素洗脫實現(xiàn)純化。
- 優(yōu)勢：
特異性極高，幾乎無非特異性結(jié)合，純化產(chǎn)物純度高；
分子量小，對目標蛋白影響��；
可在天然或變性條件下進行，可直接用于包涵體柱上復(fù)性和純化；
- 缺點：
價格較高，純化成本高于 His 標簽與 GST 標簽；
需使用高濃度生物素洗脫，可能影響部分蛋白的活性。
5、Protein Select 標簽（Cytiva專利）
Cytiva Protein Select填料是一種親和層析填料，用于純化使用自我裂解且不留痕跡的Cytiva Protein Select標簽的重組蛋白，獲得無標簽的天然蛋白質(zhì)。
- 優(yōu)勢：
使用Protein Select填料純化時，蛋白發(fā)生自裂解去除標簽，在洗脫時沒有殘留的標簽氨基酸；
- 缺點：
無成品質(zhì)粒載體，需要自己構(gòu)建質(zhì)粒時添加Protein Select標簽；
6.FLAG 標簽
FLAG 標簽是由 8 個氨基酸殘基組成的短肽標簽（DYKDDDDK），分子量約 1 kDa。其純化原理是通過抗 FLAG 抗體與標簽的特異性免疫結(jié)合實現(xiàn)目標蛋白的富集，可通過 FLAG 肽段競爭洗脫。
- 優(yōu)勢：
特異性高，抗 FLAG 抗體的識別具有高度專一性，純化產(chǎn)物純度高；
分子量小，對目標蛋白影響��；
- 缺點：
填料價格較高，純化成本高；
抗體與標簽的結(jié)合可能受緩沖液成分影響；
難再生，不適合重復(fù)使用或者批量使用；
二、標簽選擇策略與影響因素
選擇合適的標簽是實現(xiàn)目標蛋白高效純化的關(guān)鍵，需綜合考慮目標蛋白的特性、表達系統(tǒng)、實驗?zāi)康�、純化成本等因素�?/span>
（一）根據(jù)目標蛋白的特性選擇
1、蛋白可溶性：若目標蛋白為易溶性蛋白，優(yōu)先選擇分子量小、對蛋白結(jié)構(gòu)影響小的標簽（如 His 標簽、Strep 標簽）；若目標蛋白為疏水性強、易形成包涵體的難溶性蛋白，應(yīng)選擇具有促可溶性作用的標簽（如 MBP 標簽、GST 標簽），其中 MBP 標簽的促溶效果最優(yōu)，是難溶性蛋白的首選。
2、蛋白分子量：對于小分子蛋白（分子量＜20 kDa），如果使用分子量較大的標簽（如 GST、MBP）會占據(jù)目標蛋白的大部分空間，影響其結(jié)構(gòu)與功能，需要切除標簽；
3、樣品及緩沖液成分：如果緩沖液或者樣品中含有變性劑等成分，應(yīng)選擇變性環(huán)境可用的標簽（如 His 標簽、Strep 標簽），GST，MBP，F(xiàn)lag標簽在變性環(huán)境下不可用；如果樣品中含有高濃度咪唑或者DTT成分，不適合使用普通的His標簽純化柱，可以使用耐受性高的Ni Excel預(yù)裝柱和填料（貨號：29048586, 17371201）;
（二）根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇
1、實驗室小規(guī)模制備（如蛋白結(jié)構(gòu)解析、功能驗證）：如需快速獲得高純度蛋白，優(yōu)先選擇 His 標簽（操作簡便、成本低）；如果蛋白可溶性差，選擇 GST，MBP 標簽；如果樣品量較少（膜蛋白等），優(yōu)先選擇高特異性標簽（Strep標簽）；
2、工業(yè)級大規(guī)模生產(chǎn)（如生物制藥）：需綜合考慮純化效率、成本、產(chǎn)物安全性等因素。His 標簽因成本低、流程簡便，是工業(yè)生產(chǎn)的常用選擇；Strep 標簽因特異性高、產(chǎn)物純度高，適用于對純度要求極高的藥物生產(chǎn)，但需權(quán)衡成本；GST，MBP標簽需要酶切，增加步驟和成本；
三、標簽蛋白純化步驟
（1）使用蛋白純化儀器純化
以下以Cytiva的HisTrap HP 5ml（貨號：17524801）的預(yù)裝柱為例為大家介紹。根據(jù)使用的標簽，選擇對應(yīng)的純化產(chǎn)品：使用純化填料選擇小助手：三步選出最合適產(chǎn)品https://mobile.univ-bio.com/pageA/proteinTool2/proteinTool2
前期質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達的流程可以參考：原核標簽蛋白純化解決方案https://www.univ-bio.com/study-center/solution/Technology/PPP.html
正文：
1、配制緩沖液
按照以下配方進行緩沖液配制，
結(jié)合緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 20-40mM 咪唑， PH7.4
洗脫緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 500mM 咪唑， PH7.4
緩沖液配制完成后需要預(yù)先過濾和超聲去除氣泡。
其他層析柱所需緩沖液參考說明書進行配制。
2、樣品處理
大腸桿菌菌體通過離心收集（16,000g for 3 min），菌體沉淀用裂解液進行懸�。�100 μl of 50 mM Tris–HCl buffer, pH 8.0, containing 200 mM NaCl, 2% Triton X-100 and 3 mM protease inhibitor PMSF），然后冰上超聲20次（sonicated 3 s with 7 s intervals between each pulse）。
離心取上清，用0.45um濾膜進行過濾。
3、開機
先打開儀器主機電源，再打開電腦，儀器Power燈持續(xù)閃爍之后，打開Unicorn軟件并連接儀器；
4、泵洗
實驗所需溶液入口浸入去離子水，進行A，B泵泵洗；實驗所需入口浸入所需緩沖液，進行A，B泵泵洗；
5、樣品打入上樣環(huán)
連接上樣環(huán)至樣品進口閥，先使用注射器用去離子水沖洗上樣環(huán)，然后用結(jié)合緩沖液潤洗上樣環(huán)，然后打入樣品；
6、設(shè)置報警壓
設(shè)置Pre column pressure為0.5 MPa，Delta Column pressure為0.3 MPa。
7、連接層析柱
先系統(tǒng)給一個0.2ml/min的低流速，然后選擇柱位，然后使用液滴對液滴的方式連接層析柱；
8、平衡層析柱
先用3-5個柱體積的蒸餾水沖洗乙醇，然后用5個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子，建議流速為5ml/min。（1ml體積柱子流速為1ml/min）；
9、上樣
將Injection valve的狀態(tài)改為Inject；
10、洗雜
用結(jié)合緩沖液洗滌至少 10 到 15 個柱體積，直到吸收峰達到穩(wěn)定基線或在流出物中沒
有物質(zhì)流出。洗滌過程中建議保持流速為 5ml/min。（1ml體積柱子流速為1-2ml/min）；
11、洗脫
用洗脫緩沖液采用一步洗脫或者線性梯度洗脫（洗脫液濃度梯度0% to 100%）。一步洗脫通常 5 個柱體積，線性洗脫通常 10-20 個柱體積。在洗脫過程中保持流速為5ml/min。（1ml體積柱子流速為1-2ml/min）；
12、再生
洗脫后，用 3-5 個柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌柱子，然后加入 20%乙醇。擰上柱子上下的堵頭，防止柱子變干。
13、跑膠檢測
重力純化
左上角：
以下以Cytiva的Ni Sepharose 6FF 5ml（貨號：17531806）的填料為例為大家介紹。根據(jù)使用的標簽，選擇對應(yīng)的純化柱產(chǎn)品：使用純化填料選擇小助手：三步選出最合適產(chǎn)品https://mobile.univ-bio.com/pageA/proteinTool2/proteinTool2
前期質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達的流程可以參考：原核標簽蛋白純化解決方案https://www.univ-bio.com/study-center/solution/Technology/PPP.html
正文：
1、配制緩沖液
按照以下配方進行緩沖液配制，
結(jié)合緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 20-40mM 咪唑， PH7.4
洗脫緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 500mM 咪唑， PH7.4
緩沖液配制完成后需要預(yù)先過濾和超聲去除氣泡。
其他層析柱所需緩沖液參考說明書進行配制。
2、樣品處理
大腸桿菌菌體通過離心收集（16,000g for 3 min），菌體沉淀用裂解液進行懸�。�100 μl of 50 mM Tris–HCl buffer, pH 8.0, containing 200 mM NaCl, 2% Triton X-100 and 3 mM protease inhibitor PMSF），然后冰上超聲20次（sonicated 3 s with 7 s intervals between each pulse）。
離心取上清，用0.45um濾膜進行過濾。
3、層析空柱準備
將濾膜放入重力空柱中，用20%乙醇潤洗濾膜，再用蒸餾水潤洗濾膜；
4、填料準備
輕柔震蕩直到填料懸濁液均一，將需要量的懸濁液從瓶中轉(zhuǎn)移至離心管中，Ni Sepharose 6FF填料的載量是40mg His標簽重組蛋白/ml填料，例如需要純化100mg蛋白，則需要3ml填料。（每種填料的載量不同，需參考說明書）。
5、平衡填料
將填料放入重力空柱中，先用5個柱體積去離子水平衡填料，再用5個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡填料；
6、樣品結(jié)合
將填料轉(zhuǎn)移至離心管中，加入結(jié)合緩沖液和樣品，放在搖床上緩慢搖晃1h，讓樣品和填料充分混合；
7、洗雜
垂直放置重力空柱，將填料和樣品混合物加入到重力空柱中；用結(jié)合緩沖液沖洗5-10個柱體積，收集流出物；
8、洗脫
用洗脫緩沖液沖洗5-10個柱體積，收集流出物；
9、再生
洗脫后，用 3-5 個柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌柱子，然后加入 20%乙醇。擰上柱子上下的堵頭，防止柱子變干。
10、跑膠檢測
部分熱賣現(xiàn)貨產(chǎn)品
1、標簽親和層析
| 貨號 | 品名 | 規(guī)格 | 用途 |
| 17524701 | HisTrap HP | 5 × 1 ml | His標簽蛋白純化（預(yù)裝柱） |
| 17524802 | HisTrap HP | 5 × 5 ml | His標簽蛋白純化（預(yù)裝柱） |
| 17531901 | HisTrap FF | 5 × 1 ml | His標簽蛋白純化（預(yù)裝柱） |
| 17525501 | HisTrap FF | 5 × 5 ml | His標簽蛋白純化（預(yù)裝柱） |
| 29048586 | HisTrap excel | 1 x 1 ml | His標簽蛋白純化（預(yù)裝柱） |
| 29048565 | HiTrap TALON crude | 1 × 1 ml | His標簽蛋白純化（預(yù)裝柱） |
| 17526801 | Ni Sepharose HP | 25 ml | His標簽蛋白純化（填料） |
| 17526802 | Ni Sepharose HP | 100 ml | His標簽蛋白純化（填料） |
| 17531806 | Ni Sepharose 6 FF | 5 ml | His標簽蛋白純化（填料） |
| 17531801 | Ni Sepharose 6 FF | 25 ml | His標簽蛋白純化（填料） |
| 17371201 | Ni Sepharose excel | 25ml | His標簽蛋白純化（填料） |
| 17528101 | GSTrap HP | 5 × 1 ml | GST標簽蛋白純化（預(yù)裝柱） |
| 17513001 | GSTrap FF | 5 × 1 ml | GST標簽蛋白純化（預(yù)裝柱） |
| 17527901 | Glutathione Sepharose HP | 25 ml | GST標簽蛋白純化（填料） |
| 17513201 | Glutathione Sepharose 4 FF | 25 ml | GST標簽蛋白純化（填料） |
| 17075601 | Glutathione Sepharose 4B | 10 ml | GST標簽蛋白純化（填料） |
| 29401317 | StrepTrap XT | 1 × 1 ml | Strep標簽蛋白純化（預(yù)裝柱） |
| 29401324 | StrepTactin Sepharose XT | 10ml | Strep標簽蛋白純化（預(yù)裝柱） |
| 28918779 | MBPTrap HP | 1 × 5 ml | MBP標簽蛋白純化(預(yù)裝柱) |
| 28935597 | Dextrin Sepharose HP | 25ml | MBP標簽蛋白純化(填料) |
| 17542151 | HiTrap Protein Select | 1 x 1 mL | Protein Select標簽蛋白純化(預(yù)裝柱) |
| 17542101 | Protein Select resin 25 mL | 25ml | Protein Select標簽蛋白純化(填料) |
| S0B1559 | Anti-FLAG (DYKDDDDK) Tag agarose Beads | 1ml/5ml/10ml | Flag標簽蛋白純化（填料） |
2、細胞培養(yǎng)，標簽剪切酶產(chǎn)品
| 貨號 | 名稱 | 規(guī)格 |
| SH30406.05 | New Zealand FBS | 500mL |
| SV30208.02 | Australia FBS | 500mL |
| abs974 | 胎牛血清（標準級） | 500mL |
| abs972 | 胎牛血清（優(yōu)級） | 500mL |
| abs9825-1L | HEK293細胞擴增培養(yǎng)基 | 1L |
| UA070095 | Recombinant Enterokinase, His tag (High specific activity) | 500U |
| UA070003 | Recombinant Tobacco Etch Virus Protease (rTEV) | 1KU |
| UA070004 | Recombinant SUMO Protease, Yeast | 1KU |
| UA070044 | HRV 3C Protease | 500U |
