利用AKTA系統(tǒng)進(jìn)行TFF+多模態(tài)層析的大規(guī)模外泌體純化

直接作用于膜表面的溶液稱為進(jìn)料液。沿著膜表面流動(dòng)并回流至進(jìn)料儲(chǔ)罐的溶液稱為滯留液。這種溶液通常會(huì)被泵送回原處并循環(huán)使用。穿過膜的溶液稱為透過液。

尺寸排阻層析 (SEC) 通常用于病毒或細(xì)胞外囊泡（EV 或外泌體）等大型敏感分子的下游處理。但此 SEC 步驟通常被視為生產(chǎn)瓶頸 — 低流速和有限的樣本上樣量可能會(huì)降低病毒和外泌體純化的速度。開發(fā) Capto™ Core 填料，旨在解決這一瓶頸并提高大分子的下游處理能力。Core填料是包含具有活化配基的核心層和外層非活性外殼的層析填料。這種結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了雙功能作用，在內(nèi)捕獲較小的可通過外殼擴(kuò)散的雜質(zhì)，而較大的目標(biāo)分子可在流穿液中收集。通過組合尺寸排阻層析和結(jié)合層析模式，Capto™ Core 填料可作為 SEC 填料的優(yōu)先替代選擇，用于純化外泌體或其他大分子。

對(duì)于治療性外泌體，終產(chǎn)物的純度對(duì)于臨床應(yīng)用與監(jiān)管至關(guān)重要。以外泌體為基礎(chǔ)的藥物成分的生產(chǎn)中需要去除的雜質(zhì)主要是細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞DNA以及非外泌體的細(xì)胞外囊泡，比如凋亡小體和微囊泡。而外泌體的大小和理化性質(zhì)與脂蛋白、蛋白質(zhì)復(fù)合體和乳糜微粒等均有不同程度的重疊，這也為外泌體的分離與富集帶來了挑戰(zhàn)。

目前實(shí)驗(yàn)室規(guī)模已有一些常用的外泌體純化方法，包括超速離心法、免疫分離法、聚合沉淀法、切向流過濾法、分子排阻層析法和微流體分離法等，但業(yè)內(nèi)對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)外泌體的分離純化工藝還沒有達(dá)成共識(shí)。這主要是因?yàn)椴⒎撬�有方法都適用于大規(guī)模樣品的分離，而且不同方法也各有優(yōu)缺點(diǎn)，其分離純度與回收率都不盡相同。例如，最廣泛使用的超速離心法可以依據(jù)樣品大小與密度進(jìn)行純化，但難以處理大批量樣本；免疫親和捕獲獲取的外泌體純度較高，但只能特異性富集表達(dá)某幾種特異性表面蛋白質(zhì)的外泌體；微流體法操作簡(jiǎn)單，處理速度快，但依舊只適合少量樣本的提取。最近的研究表明，切向流過濾和分子排阻層析法（單獨(dú)或聯(lián)合）可以在大規(guī)模外泌體純化中發(fā)揮作用。

分子排阻層析利用外泌體和樣品中其它成分在分子大小上的差異進(jìn)行分離，這一方法可以保持樣品的完整性和生物活性，而且可以很好地進(jìn)行放大，有能力對(duì)大量樣品進(jìn)行處理。有很多研究都使用這一技術(shù)成功對(duì)外泌體進(jìn)行了分離純化，然而，這一方法也有其劣勢(shì)，流速較慢、上樣量受到體積限制、樣品純度有待進(jìn)一步提高等。

基于這一現(xiàn)狀，多模式層析填料Cytiva Capto core 700成為外泌體領(lǐng)域備受喜愛的新寵。Capto core 700由配基活化核心和5 μm惰性外殼組成，惰性外殼不允許超過700kDa的大分子進(jìn)入核內(nèi)，而外泌體樣品中的小分子，比如宿主細(xì)胞蛋白、DNA片段等，進(jìn)入核內(nèi)后，與兼具陰離子交換和疏水作用的辛胺基團(tuán)結(jié)合，從而達(dá)到分離目的。這一多模式填料通過流穿模式分離外泌體樣品，上樣量更高，而且新一代的Capto基架滿足高流速的要求，高效捕獲污染物的同時(shí)節(jié)省操作時(shí)間。

Ryan等人在進(jìn)行大規(guī)模外泌體純化的研究時(shí)，利用切向流過濾結(jié)合PEG沉淀技術(shù)以及Capto core 700層析完成了細(xì)胞培養(yǎng)上清和血漿不同樣品中外泌體的分離。在完成前處理后，利用ÄKTA Flux S系統(tǒng)，使用750kDa中空纖維濾柱（UFP-750-E-4X2MA，Cytiva）對(duì)樣品進(jìn)行約10倍的超濾濃縮，去除小分子雜質(zhì)的同時(shí)進(jìn)行換液。隨后的RNaseA處理、PEG沉淀和一步Capto core 700層析提高了外泌體純度以及同質(zhì)性。他們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，這一方法與單純的超速離心和PEG沉淀相比，得到了更高濃度的外泌體產(chǎn)品，且大小分布更均勻，具有相應(yīng)生物活性。

ÄKTA flux™過濾系統(tǒng)是一種多功能的切向流過濾(TFF)系統(tǒng)，用于樣品濃縮和隔層過濾(緩沖液交換)，以及細(xì)抱采集和澄清。該系統(tǒng)允許使用盒式過濾器空心纖維濾芯和膜吸附器進(jìn)行輕松過濾。ÄKTA flux™系統(tǒng)有兩個(gè)版本:用于研究、過濾篩分和小規(guī)模生產(chǎn)的ÄKTA flux™s系統(tǒng)，以及用于工藝開發(fā)和小規(guī)模生產(chǎn)的ÄKTA flux™6系統(tǒng)。半自動(dòng)化功能可實(shí)現(xiàn)端點(diǎn)控制、恒定保留容積(CRV)和數(shù)據(jù)記錄。這些功能可以騰出時(shí)間用于實(shí)驗(yàn)室的其他任務(wù)。通過易于使用的觸摸屏，可以方便地監(jiān)控和處理工藝信息和控制。該系統(tǒng)可以處理較低的工作量，以支持廣泛的濃度因子。ÄKTA flux™過濾系統(tǒng)非常適合用于蛋白質(zhì)純化和澄清，作為AKTA的補(bǔ)充層析系統(tǒng)。

低工作體積支持廣泛的濃度因子。

自動(dòng)終點(diǎn)控制和數(shù)據(jù)記錄可釋放實(shí)驗(yàn)室中其他任務(wù)的時(shí)間。

靈活的操作方式支持同時(shí)使用中空纖維濾芯和卡盒。

多功能設(shè)計(jì)支持超濾和微濾應(yīng)用。

易于使用的操作界面簡(jiǎn)化了系統(tǒng)操作。AKTA fux6系統(tǒng)適用于GMP監(jiān)管環(huán)境，支持符合21CFR第11部分的要求。

綜合上述分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，AKTA系統(tǒng)憑借其完善的技術(shù)配置與靈活的應(yīng)用能力，無疑為TFF與多模態(tài)層析聯(lián)合實(shí)現(xiàn)大規(guī)模外泌體純化提供了可靠支撐。ÄKTA flux系列切向流過濾系統(tǒng)通過高效的超濾濃縮、換液與雜質(zhì)初步去除，為后續(xù)純化奠定了優(yōu)質(zhì)樣品基礎(chǔ)，其低工作體積、自動(dòng)化控制等優(yōu)勢(shì)適配大規(guī)模處理需求；而Cytiva Capto Core系列多模態(tài)層析填料作為核心分離單元，與AKTA系統(tǒng)無縫兼容，以流穿模式實(shí)現(xiàn)外泌體與小分子雜質(zhì)的高效分離，解決了傳統(tǒng)方法流速慢、上樣量有限的瓶頸。Ryan等人的研究已明確證實(shí)，依托ÄKTA Flux S系統(tǒng)的TFF工藝與Capto Core 700層析的聯(lián)合應(yīng)用，能夠高效獲得高濃度、高同質(zhì)性且保留生物活性的外泌體產(chǎn)品，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)純化手段。在治療性外泌體對(duì)純度與規(guī)模化生產(chǎn)的雙重要求下，AKTA系統(tǒng)所支撐的TFF+多模態(tài)層析技術(shù)，不僅突破了現(xiàn)有工藝的局限，更為外泌體的臨床轉(zhuǎn)化與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)保障，成為大規(guī)模外泌體純化領(lǐng)域極具應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)選方案。