CAR-T細胞療法從In vitro CAR-T到In vivo CAR-T的范式轉(zhuǎn)變及兩者對比

本文來源于微信公眾： Cell Culture     作者： 猶八
（一）In vivo CAR-T VS In vitro CAR-T 治療優(yōu)勢
體外與體內(nèi) CAR-T 細胞療法的比較:
（1）制備工藝：In vivo CAR-T 的制造技術(shù)與GMP更加兼容，成本低廉，管理流程簡單，避免了繁瑣的制備流程，穩(wěn)定、好用，可大規(guī)模生產(chǎn)的特點;
（2）臨床應(yīng)用：現(xiàn)貨型產(chǎn)品，避免“一患一制”，快速交付，提高患者可及性;
（3）安全性：不需進行輸注前淋巴耗竭化療，避免造成的相關(guān)毒性。

圖 1 : 體外和體內(nèi)CAR-T細胞治療的比較。體外 CAR-T 需要經(jīng)過體外制造，經(jīng)過T細胞分離、重編程、擴增、收獲凍存等體外制造步驟，并且在 CAR -T 細胞輸注之前，需要進行淋巴耗竭化療（LC），易于產(chǎn)生毒性。體外生產(chǎn)是“一患一制”，價格昂貴、流程繁瑣，通用型體外 CAR-T安全性差。體內(nèi)生產(chǎn) CAR -T 細胞只需要注入納米顆�；驍y帶病毒的CAR，這種CAR是“現(xiàn)貨型的”、成本低廉、質(zhì)量穩(wěn)定的，與GMP更加兼容，可以大規(guī)模生產(chǎn)。

（二）體外 CAR-T 和體內(nèi) CAR-T 基因工程改造進展
體外 CAR-T 主要在體外使用遞送系將CAR基因?qū)�入T細胞，在體外擴增工程化的 CAR-T 細胞，然后將 CAR-T 細胞重新輸注給患者，輸入體內(nèi)的 CAR-T 細胞通過表面 scFv 片段靶向腫瘤細胞表面受體，由T細胞對腫瘤細胞進行精準殺傷。

體外 CAR-T 的核心作用原件為 CAR 結(jié)構(gòu)，至今 CAR-T 細胞的 CAR 機構(gòu)共進行了5代更新，第一代 CAR 結(jié)構(gòu)由 scFv 和含有Fc受體γ鏈（FcγR）或單獨CD3ζ鏈的細胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域組成。第一代 CAR 的持久性較差，抗腫瘤療效較低。為提高持久性，第二代 CAR 在一代的基礎(chǔ)上，在 CD3ζ 之外，增加了一種共刺激分子，如 CD28 或 4-1BBL 或 OX40 等中的一種。第三代 CAR 是在 CD3ζ 的基礎(chǔ)上，增加兩種不同的刺激閾如 CD28 和 4-1BBL。第四代 CAR 也稱為“重定向用于普遍細胞因子殺傷的T細胞”（TRUCKs），在第二代 CAR 的基礎(chǔ)上，增加了T細胞活化核因子（如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18）。第五代 CAR 在第二代 CAR 的基礎(chǔ)上增加了一段截短細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，如來源于 IL-2 受體的β鏈（IL-2Rβ），旨在抑制免疫檢查點減少CART細胞耗竭并增強抗腫瘤活性如下圖2：

圖 2 : 體外CAR-T 細胞CAR結(jié)構(gòu)的五代演化。

體內(nèi) CAR-T 通過在體外制備產(chǎn)品化的遞送系統(tǒng)。遞送系統(tǒng)包括病毒遞送系統(tǒng)（慢病毒和腺病毒遞送載體）和非病毒遞送系統(tǒng)（脂質(zhì)納米粒載體、聚合物納米粒載體和外泌體），如圖3。產(chǎn)品化的遞送系統(tǒng)經(jīng)過回輸進入人體，通過細胞融合作用，將攜帶的 CAR 基因重組到T細胞基因組，借用T細胞的基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達，實現(xiàn)T細胞在人體內(nèi)的編輯，在原位產(chǎn)生 CAR-T 細胞，由CAR-T細胞實現(xiàn)對腫瘤的靶向殺傷作用，如圖4。

圖 3 ：體內(nèi) CAR-T 遞送系統(tǒng)，慢病毒LV，腺病毒AAV，LNP 納米微載體，Plymer聚合物納米粒載體， Exosome外泌體。

圖 4：體內(nèi) CAR-T 遞送系統(tǒng)。LV含有一種或多種病毒糖蛋白（藍色）和包裝在核衣殼中的ssRNA基因組，根據(jù)糖蛋白的不同結(jié)合不同的細胞，通過細胞膜內(nèi)吞作用將核酸轉(zhuǎn)移到T細胞中，并整合到宿主基因組中。（B）AAV由二十面體蛋白衣殼中包裹著ssDNA基因組組成，細胞通過內(nèi)吞作用攝取后，基因定向轉(zhuǎn)移到細胞核中。（C）編碼CAR的核酸與帶正電荷的可生物降解聚合物（NC）或脂質(zhì)（LNP）復(fù)合形成載體復(fù)合物。進入細胞后，mRNA有效載荷（1）可用于翻譯。包裝DNA 轉(zhuǎn)座酶可能到達細胞核，整合到宿主染色質(zhì)中。

不同的體內(nèi) CAR-T 遞送方式均存在一定的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)，慢病毒和腺病毒遞送方式在B淋巴細胞瘤清除上面顯示出一定的治療效果，但也存在免疫原性和插入性致癌的風(fēng)險。脂質(zhì)微球遞送系統(tǒng)在心臟耗竭、抗白血病、實體瘤和血液瘤體的應(yīng)用上顯示一定的治療前景，但也存在轉(zhuǎn)染效率和嚴格的生產(chǎn)規(guī)范要求等問題，如下表所示：

（三）In vivo CAR-T 的體外制造技術(shù)
不同于體外 CAR-T 的制造和應(yīng)用，需要經(jīng)過從人體中分離出T細胞，使用工程化的手段如病毒轉(zhuǎn)染、基因編輯等手段將核酸復(fù)合物定向到T細胞進行CAR裝載，擴大培養(yǎng)T細胞實現(xiàn)細胞增殖，細胞收獲、灌裝、凍存，放行入庫，細胞復(fù)蘇，多次回輸，長期隨訪。體內(nèi)CART體外制造工序只需要在體外生產(chǎn)制備遞送系統(tǒng)的如圖5：

圖 5：體外CAR-T和體內(nèi) CAR-T 制造和應(yīng)用。

慢病毒遞送系統(tǒng)制備系統(tǒng)常采用尼帕病毒（NiV）和麻疹病毒（MV）的胞膜蛋白，工程改造的關(guān)鍵是改造慢病毒的膜融合和T細胞靶向性，并將CAR基因包裝到慢病毒。如對慢病毒天然的胞膜蛋白（如水皰性口炎病毒G蛋白，VSV-G）進行改造，使其更容易和T細胞進行膜融合，將原病毒糖蛋白替換為靶向T細胞的 scFvs的CD3/CD4/CD8配體。腺病毒是由24面體蛋白衣殼和單鏈DNA基因組，基因組包括rep和cap基因；rep編碼復(fù)制和包裝所必須的非結(jié)構(gòu)蛋白，cap編碼衣殼決定感染傾向，通過在AAV基因組中T細胞靶向部分，使其中保持轉(zhuǎn)染性和T細胞靶向性。AV攜帶的轉(zhuǎn)基因通常以圓形雙鏈游離體的形式進入細胞核，不整合到基因組中，這意味著這些游離體將隨著宿主的分裂而失去表達，如圖6所示：

圖 6：用于體內(nèi)生成 CAR-T 細胞的慢病毒和腺病毒策略，需要通過突變附著糖蛋白來消除其天然嗜性，并通過引入T細胞特異性結(jié)構(gòu)域來原位改造T細胞。

使用脂質(zhì)微粒制備體內(nèi) CAR-T 遞送體統(tǒng)，包括陽離子聚合物的納米顆粒，脂質(zhì)體的納米微粒，以及基于肽類的脂質(zhì)體，陽離子聚合物通過靜電相互作用與帶負電荷的核酸緊密結(jié)合，并凝聚成納米復(fù)合物，避免被免疫系統(tǒng)消滅；脂質(zhì)體納米顆粒是由磷脂雙層組成的人工囊泡，利用超聲水合將DNA包裹進人工囊泡，如圖7所示�；�于肽的脂質(zhì)體是一種通過自組裝形成的非空泡納米結(jié)構(gòu)顆粒，是核酸治療領(lǐng)域最先進、臨床上最成功的非病毒遞送平臺之一，在mRNA疫苗和基因治療中具有特別有前景的應(yīng)用，包括tLPPs靶向脂質(zhì)體，SORT脂質(zhì),包裝過程如圖8所示。

圖 7：體內(nèi) CAR 療法的陽離子聚合物和基于脂質(zhì)體LNP的示意圖。（A）陽離子聚合物納米遞送載體需要四個基本成分，包括陽離子聚合物、靶向配體、輔助元件和遞送的CAR基因載體。（B）共擠法生產(chǎn)脂質(zhì)體納米載體。制備的脂質(zhì)體化納米轉(zhuǎn)運蛋白可誘導(dǎo)注射后胰腺癌癥TME原位生成CAR-MΦ，并可介導(dǎo)腫瘤殺傷。

圖 8：靶向 LNPs 和 SORT LNPs 介導(dǎo)體內(nèi) CAR 細胞療法的示意圖。將 CAR 基因載體包裹在 tLNPs 中的過程，靶向T細胞，然后在體內(nèi)對循環(huán)T淋巴細胞進行重編程，在原位生成 CAR-T細胞，在 TME 中原位產(chǎn)生CAR-MΦ。

（四）In-vivo CAR-T 的前景
最近，體內(nèi) CAR T 細胞療法因其簡單的制造工藝、可控的批次間差異和“現(xiàn)貨型”的特點而引起了人們的持續(xù)興趣。更重要的是，體內(nèi) CAR-T 細胞可以大規(guī)模生產(chǎn)，這可能會降低成本并擴大臨床應(yīng)用。目前，F(xiàn)DA批準的體外 CAR-T 產(chǎn)品均只在血液瘤方面展現(xiàn)臨床效果，并存在 CAR 隨機整合導(dǎo)致的致瘤，免疫抑制以及細胞因子風(fēng)暴的風(fēng)險。體內(nèi) CAR-T 能夠很好低規(guī)避體外 CAR-T 的弊端，體內(nèi) CAR-T 靶向腫瘤微環(huán)境不僅產(chǎn)生 CAR-T 還產(chǎn)生 CAR-NK 和 CAR-M 細胞，對實體瘤體展現(xiàn)出一定的清除作用。無須回輸細胞，不需要清淋處理，避免對免疫系統(tǒng)的損害。無需異體細胞回輸避免宿主免疫抑制，展現(xiàn)出生物制造和臨床應(yīng)用的優(yōu)勢。作為一種有前景的免疫療法，體內(nèi) CAR-T 細胞治療受到各種限制的阻礙，包括病毒載體遞送效率、免疫反應(yīng)、耐久性和實體瘤適應(yīng)性。然而，隨著基因編輯技術(shù)、靶向遞送系統(tǒng)和 CAR 結(jié)構(gòu)設(shè)計的不斷優(yōu)化，這些問題有望得到解決。體內(nèi) CAR-T 療法正逐步從實驗室走向臨床。在血液腫瘤中，體內(nèi) CAR-T 細胞治療已顯示出巨大的臨床潛力。此外，這種新型療法在治療實體瘤方面取得了突破。與免疫檢查點抑制劑（如PD-1抗體）或細胞因子（如IL-12工程外泌體）的組合策略可以進一步將應(yīng)用范圍擴展到其他適應(yīng)癥。臨床前研究和早期臨床試驗表明，體內(nèi) CAR-T 細胞療法是安全有效的。隨著創(chuàng)新遞送技術(shù)、擴大適應(yīng)癥和優(yōu)化安全性的顯著進步，體內(nèi) CAR-T 細胞治療有望成為未來腫瘤免疫治療的關(guān)鍵策略，為癌癥患者帶來更有效、更安全的治療選擇。體內(nèi) CAR-T 可能是未來的細胞治療研究方向。