為何選TFF+SEC工藝：外泌體純化核心優(yōu)勢(shì)及思拓凡CAP™應(yīng)用案例

切向流過(guò)濾（TFF）和尺寸排阻色譜（SEC）是兩種常用于從復(fù)雜生物流體中富集外泌體的方法。結(jié)合這些著名的技術(shù)（它們是溫和的外泌體純化方法），可以去除大部分宿主細(xì)胞蛋白（HCP）和DNA。此外，這種工作流程回收率高，并能最大限度地減少純化外泌體生物活性的損失。

已知在不同培養(yǎng)基和條件下培養(yǎng)的不同細(xì)胞類型所產(chǎn)生的外泌體，會(huì)呈現(xiàn)出不同的糖基化模式和表面蛋白——這不僅會(huì)影響其生物活性，還會(huì)影響外泌體與過(guò)濾膜和層析樹(shù)脂的相互作用。我們?yōu)槿�種細(xì)胞系開(kāi)發(fā)了一種溫和且可擴(kuò)展的工作流程，并在思拓凡的羊水細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞（CAP™）的結(jié)果進(jìn)行了評(píng)估：

在該工作流程中，使用了Cytiva的羊膜細(xì)胞生產(chǎn)（CAP™）細(xì)胞系來(lái)生產(chǎn)外泌體，這些外泌體表面有與CD63相連的綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽，用于熒光檢測(cè)。為了確定TFF-SEC方案的可重復(fù)性，對(duì)GFP-外泌體CAP™條件培養(yǎng)基上清進(jìn)行了兩次獨(dú)立的富集，先采用TFF，再通過(guò)superSEC樹(shù)脂進(jìn)行純化。與實(shí)施例1相同，進(jìn)行了兩種規(guī)模的純化——兩個(gè)HiScreen™柱，以及一個(gè)床高為20厘米的HiScale™ 26/40柱，詳見(jiàn)材料和方法中的表1。對(duì)回收率和外泌體濃度進(jìn)行了測(cè)量，包括顆粒數(shù)（NTA）、CD63（ELISA）、總蛋白和單鏈DNA含量分析。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡（Wb）和掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)收集到的組分中的顆粒進(jìn)行了最終鑒定確認(rèn)。

將250毫升CAP™ CCS的樣品負(fù)荷施加到TFF中空纖維膜（截留分子量750 kDa）上，進(jìn)行過(guò)濾。TFF步驟后收集了25毫升樣品。大約97%的DNA和92%的蛋白質(zhì)被去除。根據(jù)納米顆粒跟蹤分析（NTA），TFF后保留的顆粒產(chǎn)量為初始顆粒濃度的56%。通過(guò)CD63酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分析，外泌體回收率為43%。

然后將TFF保留物上樣到色譜柱中——1毫升上樣到HiScreen™ superSEC色譜柱，15毫升上樣到HiScale™色譜柱。色譜圖如圖7所示。490納米吸光度曲線顯示，GFP外泌體在兩種色譜柱形式中均在第一個(gè)峰中洗脫出來(lái)，且在第二個(gè)峰中未檢測(cè)到490納米吸光度。HiScreen™和HiScale™ superSEC色譜柱的運(yùn)行時(shí)間分別為20分鐘（流速129厘米/小時(shí)）和45分鐘（流速45厘米/小時(shí)）。算上色譜柱的平衡和清洗時(shí)間，一次運(yùn)行的總時(shí)間分別為1小時(shí)和2小時(shí)。

HiScale™層析柱運(yùn)行結(jié)果證實(shí)，外泌體和蛋白質(zhì)污染物也能在更大規(guī)模下實(shí)現(xiàn)分離。切向流過(guò)濾（TFF）過(guò)程中的核酸酶處理是有效的，且能改善宿主DNA的去除效果——采用核酸酶處理的TFF步驟后，外泌體樣品中97%的DNA殘留被去除，而未使用核酸酶時(shí)僅能去除40%。superSEC樹(shù)脂純化步驟進(jìn)一步提高了外泌體組分中DNA的去除率，這證實(shí)superSEC可作為外泌體純化第二步的有效替代方法。納米顆粒追蹤分析（NTA）還顯示，在整個(gè)過(guò)程中，顆粒的平均尺寸（150至160納米）沒(méi)有變化。

為進(jìn)一步確認(rèn)所收集的組分中存在外泌體，我們使用CD81和TSG101抗體進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡（Wb）分析，并通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)行了電鏡分析。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果證實(shí)，這些囊泡表達(dá)CD81和TSG101，不過(guò)TSG101僅在切向流過(guò)濾（TFF）截留物中被檢測(cè)到，這可能是由于體積排阻色譜（SEC）組分中的濃度較低。

掃描電鏡分析圖像顯示存在具有典型杯狀形態(tài)的囊泡，且TFF-SEC流程去除了雜質(zhì)。

綜上，TFF與SEC工藝的組合憑借溫和性、高效除雜能力、高回收率、良好可擴(kuò)展性及對(duì)生物活性的保留優(yōu)勢(shì)，成為外泌體純化的優(yōu)選方案，完美契合外泌體功能研究、臨床應(yīng)用及規(guī)�；�生產(chǎn)的核心需求。思拓凡（Cytiva）已成功將該工藝應(yīng)用于CAP™細(xì)胞系產(chǎn)生的GFP外泌體純化，通過(guò)實(shí)際應(yīng)用驗(yàn)證了其在不同規(guī)模下的穩(wěn)定性與可靠性。隨著外泌體技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深入發(fā)展，TFF+SEC組合工藝將持續(xù)為各類細(xì)胞系來(lái)源外泌體的高效純化提供有力支撐，推動(dòng)外泌體從實(shí)驗(yàn)室研究走向更廣泛的臨床轉(zhuǎn)化與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。