斜向光熱顯微鏡實(shí)現(xiàn)活體亞微米分辨率的高靈敏度紅外光譜成像

紅外光譜成像在活體研究中面臨靈敏度低和分辨率差的挑戰(zhàn)，尤其是在反射模式下。為了突破這一瓶頸，本研究報(bào)道了一種斜向光熱顯微鏡（Oblique Photothermal Microscope, OPTM），實(shí)現(xiàn)了活體亞微米分辨率的高靈敏度紅外光譜成像。傳統(tǒng)光熱測(cè)量?jī)H通過(guò)光圈捕獲少量探針光子來(lái)提取光熱信號(hào)，而OPTM采用差分分裂檢測(cè)器放置在樣品表面，收集更多光子并通過(guò)平衡檢測(cè)抑制激光噪聲。憑借其提升的靈敏度，OPTM能夠在無(wú)光損傷條件下對(duì)皮膚進(jìn)行低劑量紅外成像。實(shí)驗(yàn)展示了小鼠和人類(lèi)皮膚下層代謝標(biāo)記物的深度分辨活體成像，并追蹤了局部藥物在皮膚內(nèi)的分布。OPTM為活體原位分子分析提供了一個(gè)高靈敏度成像平臺(tái)。

本論文的重要發(fā)現(xiàn)者包括Mingsheng Li、Sheng Xiao、Hongli Ni、Guangrui Ding、Yuhao Yuan、Carolyn Marar、Jerome Mertz和Ji-Xin Cheng。他們共同發(fā)表的論文“Ultrasensitive in vivo infrared spectroscopic imaging via oblique photothermal microscopy”于2025年7月在《Nature Communications》期刊上在線(xiàn)發(fā)表。

重要發(fā)現(xiàn)
01技術(shù)原理與仿真結(jié)果
斜向光熱顯微鏡（OPTM）的核心創(chuàng)新在于其檢測(cè)策略的變革。傳統(tǒng)中紅外光熱（MIP）顯微鏡在反射模式下使用光圈過(guò)濾后向散射光子，導(dǎo)致光子收集效率低。OPTM則通過(guò)將差分分裂檢測(cè)器直接置于樣品表面，收集斜向傳播的探針光子，從而大幅提升信號(hào)捕獲能力。仿真結(jié)果顯示，OPTM的光子收集效率比傳統(tǒng)方法提高約500倍，同時(shí)通過(guò)平衡檢測(cè)將激光噪聲抑制12倍。這種設(shè)計(jì)利用光熱調(diào)制引起的折射率變化，生成光熱相位梯度信號(hào)，作為分子敏感性的高效讀出機(jī)制。

OPTM儀器設(shè)計(jì)包括脈沖紅外激光和連續(xù)波可見(jiàn)激光作為泵浦和探針源，通過(guò)反射中繼光學(xué)和反射物鏡減少色差。信號(hào)處理流程將分裂檢測(cè)器的輸出分為AC和DC成分，通過(guò)鎖相放大和向量運(yùn)算生成光熱相位梯度圖像和吸收?qǐng)D像，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)分子成像。

活體小鼠皮膚成像展示了OPTM在生物醫(yī)學(xué)中的潛力。通過(guò)多光譜成像，OPTM區(qū)分了脂肪細(xì)胞中的游離脂肪酸和脂質(zhì)酯，其信噪比優(yōu)于傳統(tǒng)MIP顯微鏡8倍。深度分辨成像揭示了皮膚不同層（如角質(zhì)層、表皮層）的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分布，分辨率達(dá)亞微米級(jí)。

藥物追蹤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步凸顯了OPTM的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)局部施用過(guò)氧化苯甲酰（BPO）的活體小鼠皮膚進(jìn)行深度成像，結(jié)合LASSO光譜解混算法，量化了藥物在毛囊中的遞送效率。結(jié)果顯示，BPO主要通過(guò)毛囊開(kāi)口滲透，但效率低于30%，為藥物開(kāi)發(fā)提供了新見(jiàn)解。

人類(lèi)皮膚成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)了OPTM的臨床適用性。在志愿者前臂皮膚中，OPTM無(wú)創(chuàng)可視化了代謝標(biāo)記物和藥物分布，展示了其在健康診斷和透皮藥物監(jiān)測(cè)中的前景。OPTM通過(guò)斜向光熱檢測(cè)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、高分辨率的活體紅外成像。其技術(shù)優(yōu)勢(shì)包括提升的光子收集效率、有效的噪聲抑制以及深度分辨能力，為生物醫(yī)學(xué)研究提供了強(qiáng)大工具。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破成像難題
OPTM解決了活體紅外光譜成像的兩大核心難題：靈敏度和分辨率不足。傳統(tǒng)技術(shù)如傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和光聲紅外顯微鏡受限于衍射極限和光子衰減，無(wú)法在活體中實(shí)現(xiàn)微米級(jí)成像。OPTM通過(guò)斜向檢測(cè)策略，將光子收集效率提升500倍，噪聲抑制12倍，打破了活體應(yīng)用的壁壘。其亞微米分辨率克服了紅外波長(zhǎng)的衍射限制，使納米級(jí)化學(xué)可視化在活體中成為可能。

總結(jié)與展望
OPTM技術(shù)通過(guò)斜向光熱檢測(cè)機(jī)制，顯著提升了活體紅外光譜成像的靈敏度和分辨率，為分子級(jí)生物醫(yī)學(xué)研究開(kāi)辟了新道路。其創(chuàng)新性體現(xiàn)在光子收集效率的優(yōu)化和噪聲抑制策略上，成功應(yīng)用于小鼠和人類(lèi)皮膚的代謝標(biāo)記物成像及藥物追蹤。未來(lái)，通過(guò)使用更長(zhǎng)波長(zhǎng)的探針光源，OPTM有望進(jìn)一步增加穿透深度，擴(kuò)展至更復(fù)雜的組織成像。此外，結(jié)合計(jì)算重建方法如希爾伯特變換，可以提升圖像質(zhì)量，減少偽影。OPTM作為一個(gè)平臺(tái)技術(shù)，不僅限于中紅外窗口，還可適配于其他光熱顯微鏡系統(tǒng)，推動(dòng)其在基礎(chǔ)研究和臨床翻譯中的廣泛應(yīng)用。總之，OPTM代表了活體分子成像的重要進(jìn)展，有望在疾病診斷和藥物開(kāi)發(fā)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

DOI:10.1038/s41467-025-61332-w.