高通量雙光子成像技術(shù)兆赫級(jí)掃描大腦神經(jīng)元活動(dòng)

理解大腦如何工作，需要我們能夠窺視其內(nèi)部密集的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，觀察它們是如何被激活并相互“交流”的。在活體大腦中，同時(shí)、快速、清晰地對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)進(jìn)行成像，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域長(zhǎng)期追求的目標(biāo)。近日，一項(xiàng)發(fā)表于頂級(jí)期刊的研究介紹了一種名為FACED 2.0的革命性成像技術(shù)，它猶如為觀察大腦內(nèi)部世界安裝了一臺(tái)“超高速、超高清攝像機(jī)”，首次實(shí)現(xiàn)了在活體動(dòng)物中同時(shí)對(duì)數(shù)百個(gè)神經(jīng)元的電壓信號(hào)和上萬(wàn)個(gè)神經(jīng)元的鈣信號(hào)進(jìn)行大規(guī)模記錄，將神經(jīng)活動(dòng)成像的尺度、速度和分辨率推向了前所未有的新高度。

這項(xiàng)突破性研究由Jian Zhong、Ryan G. Natan、Qinrong Zhang、Justin S. J. Wong、Christoph Miehl、Krishnashish Bose、Xiaoyu Lu、Francois St-Pierre、Su Guo、Brent Doiron、Kevin K. Tsia和Na Ji共同完成。他們的研究成果以題為“FACED 2.0 enables large-scale voltage and calcium imaging in vivo”的論文形式在線發(fā)表在《自然-方法》（Nature Methods）期刊上。

重要發(fā)現(xiàn)
01重新定義高速成像的邊界
本論文的核心在于對(duì)FACED（自由空間角度啁啾增強(qiáng)延遲）成像技術(shù)進(jìn)行了全面升級(jí)，推出了FACED 2.0系統(tǒng)。傳統(tǒng)雙光子熒光顯微鏡的成像速度受限于機(jī)械式掃描鏡的慣性，其線掃描率通常僅為每秒數(shù)萬(wàn)次，導(dǎo)致成像幀率有限。FACED技術(shù)的精髓在于，它采用了一種全光學(xué)的、被動(dòng)的掃描模塊，通過(guò)一對(duì)近乎平行的反射鏡將單個(gè)激光脈沖“復(fù)制”成在空間上分離、時(shí)間上延遲的一系列焦點(diǎn)陣列。這個(gè)陣列本身就構(gòu)成了一次線掃描，其掃描速率直接等于激光的重復(fù)頻率，可輕松達(dá)到兆赫級(jí)別，是傳統(tǒng)方法的數(shù)十倍。

FACED 2.0在此基礎(chǔ)上，通過(guò)硬件和軟件的協(xié)同優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了在超大視野和三維體積內(nèi)，以亞細(xì)胞分辨率進(jìn)行連續(xù)、超快的成像。其像素率高達(dá)每秒10億像素，同時(shí)保持了與傳統(tǒng)方法相媲美的空間分辨率和成像深度。

為了獲得二維圖像，系統(tǒng)使用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的振鏡掃描鏡沿垂直于這條“光針”線的方向進(jìn)行慢速掃描，從而完成逐行掃描。為了進(jìn)一步擴(kuò)大成像視野，F(xiàn)ACED 2.0引入了第二個(gè)振鏡，用于橫向拼接多個(gè)高速的FACED視野。例如，通過(guò)拼接八個(gè)視野，可以在0.8數(shù)值孔徑的物鏡下，以每幀5.3毫秒的速度采集超過(guò)1.1毫米 x 1.0毫米的超大范圍。為了實(shí)現(xiàn)高速三維體成像，系統(tǒng)通過(guò)一個(gè)快速壓電平臺(tái)軸向振蕩物鏡，由于FACED 2.0的毫秒級(jí)幀采集時(shí)間，連續(xù)的軸向移動(dòng)不會(huì)產(chǎn)生幀內(nèi)運(yùn)動(dòng)偽影。

重要的是FACED 2.0在追求速度的同時(shí)并未犧牲分辨率。在整個(gè)拼接視野內(nèi)，它對(duì)200納米熒光珠成像的橫向分辨率在半高全寬尺度上優(yōu)于1.3微米，軸向分辨率優(yōu)于5微米。這足以在三維空間內(nèi)分辨尺寸小至10微米的神經(jīng)元胞體，為準(zhǔn)確測(cè)量單個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)奠定了基礎(chǔ)。

隨后，研究展示了FACED 2.0在大規(guī)模電壓成像上的里程碑式能力。利用表達(dá)基因編碼電壓指示劑JEDI-2P-Kv的小鼠，他們同時(shí)記錄了視覺(jué)皮層182個(gè)第2/3層神經(jīng)元的電壓活動(dòng)，幀率高達(dá)每秒800幀。這不僅捕捉到神經(jīng)元放電的尖峰信號(hào)，還首次在如此大規(guī)模的群體中，同步記錄到了與輸入信息相關(guān)的閾下膜電位波動(dòng)。數(shù)據(jù)分析揭示了神經(jīng)元群體輸入與輸出活動(dòng)關(guān)聯(lián)性的新特征，并測(cè)量了數(shù)百個(gè)神經(jīng)元將膜電位轉(zhuǎn)化為放電頻率的輸入-輸出函數(shù)冪律指數(shù)。

最后，FACED 2.0在高通量三維鈣成像方面的威力得到了充分展現(xiàn)。在清醒的轉(zhuǎn)基因小鼠視覺(jué)皮層，研究人員對(duì)一個(gè)1.1毫米 x 1.0毫米 x 0.4毫米的體積進(jìn)行成像，以每體積259.7毫秒的速度，從該體積內(nèi)手動(dòng)分割了13,962個(gè)神經(jīng)元，并基于其活動(dòng)識(shí)別出12,511個(gè)獨(dú)立神經(jīng)元，其中超過(guò)九千個(gè)表現(xiàn)出視覺(jué)誘發(fā)的方向選擇性反應(yīng)。此外，在野生型小鼠中，成像深度可達(dá)皮層下約750微米，同時(shí)記錄了跨越整個(gè)皮層深度的14,005個(gè)神經(jīng)元的鈣活動(dòng)。對(duì)于斑馬魚幼魚這類小腦模型，F(xiàn)ACED 2.0能夠以每體積96毫秒的速度對(duì)其全腦進(jìn)行快速三維鈣成像，識(shí)別出自發(fā)活動(dòng)的神經(jīng)元集群。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
解決“速度-分辨率-范圍”不可能三角。
傳統(tǒng)高速成像技術(shù)往往需要在成像速度、空間分辨率（尤其是軸向分辨率）和成像范圍之間做出妥協(xié)。FACED 2.0的核心創(chuàng)新在于，它采用高數(shù)值孔徑的聚焦光點(diǎn)，以兆赫茲的線掃描速率順序掃描樣品，并通過(guò)非成像探測(cè)器收集熒光。這種設(shè)計(jì)使其保持了傳統(tǒng)雙光子顯微鏡的光學(xué)層切能力和深層成像優(yōu)勢(shì)，同時(shí)在實(shí)現(xiàn)高速成像時(shí)完全不犧牲軸向分辨率。與其他高通量熒光成像方法相比，F(xiàn)ACED 2.0在高吞吐量、高時(shí)空分辨率和大的成像深度三者之間取得了最佳平衡。

實(shí)現(xiàn)大規(guī)模神經(jīng)元電壓活動(dòng)直接觀測(cè)。
電壓成像直接反映神經(jīng)元的膜電位變化，是研究神經(jīng)信息處理的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因其信號(hào)微弱、對(duì)速度要求極高，長(zhǎng)期以來(lái)難以進(jìn)行大規(guī)模群體記錄。FACED 2.0憑借其極高的成像速度和信噪比，首次利用雙光子激發(fā)實(shí)現(xiàn)了對(duì)超過(guò)200個(gè)神經(jīng)元的群體電壓成像，并能同時(shí)解析其閾下和閾上活動(dòng)。這為在系統(tǒng)水平上研究神經(jīng)環(huán)路的輸入-輸出轉(zhuǎn)換、相關(guān)性機(jī)制等基本問(wèn)題打開了全新的窗口。

“暗態(tài)弛豫”帶來(lái)更高的光子效率。
大多數(shù)雙光子顯微鏡系統(tǒng)使用約80 MHz重復(fù)頻率的激光，這意味著每個(gè)像素在每幀內(nèi)會(huì)受到多個(gè)激光脈沖的激發(fā)。而在FACED 2.0中，每幀內(nèi)每個(gè)像素僅被一個(gè)激光脈沖激發(fā)。在每秒1000幀的速率下，后續(xù)的激發(fā)脈沖要間隔1毫秒才會(huì)再次到達(dá)同一樣品位置。這為熒光分子從其易于受損的暗態(tài)恢復(fù)到基態(tài)提供了充足的時(shí)間，即“暗態(tài)弛豫”效應(yīng)。該效應(yīng)已被證明能將雙光子成像的光子產(chǎn)量提高數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，F(xiàn)ACED 2.0能夠以與傳統(tǒng)方法相似的激發(fā)功率，在更高的幀率下成像，同時(shí)保持良好的信噪比。

總結(jié)與展望
FACED 2.0通過(guò)其獨(dú)特的全光學(xué)兆赫線掃描設(shè)計(jì)，成功突破了傳統(tǒng)雙光子顯微鏡在速度、規(guī)模和分辨率方面的限制，為神經(jīng)科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究提供了一款強(qiáng)大的體內(nèi)成像工具。它不僅在技術(shù)層面實(shí)現(xiàn)了對(duì)數(shù)百神經(jīng)元電壓活動(dòng)和數(shù)萬(wàn)神經(jīng)元鈣活動(dòng)的同時(shí)記錄，更在科學(xué)層面帶來(lái)了關(guān)于神經(jīng)元群體編碼與轉(zhuǎn)換規(guī)律的新發(fā)現(xiàn)。

展望未來(lái)，隨著更明亮、更靈敏的熒光指示劑的不斷開發(fā)，F(xiàn)ACED 2.0的成像能力有望進(jìn)一步提升，覆蓋更廣闊的腦區(qū)或更多的神經(jīng)元。同時(shí)，改進(jìn)系統(tǒng)的機(jī)械穩(wěn)定性、激光性能和光束穩(wěn)定技術(shù)，將使其操作更加簡(jiǎn)便，更適合長(zhǎng)期、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)需求。這項(xiàng)技術(shù)標(biāo)志著高速高分辨活體成像進(jìn)入了一個(gè)新紀(jì)元，將繼續(xù)推動(dòng)我們?cè)谔剿鞔竽X奧秘和生命動(dòng)態(tài)過(guò)程的道路上不斷前進(jìn)。

doi: 10.1038/s41592-025-02925-7.