TR‑FRET、THUNDER檢測技術在PROTAC藥物研發(fā)中的應用
近年來，生物醫(yī)藥領域風起云涌，一種名為PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）的新型藥物研發(fā)策略引起了廣泛關注，被譽為“顛覆傳統(tǒng)的小分子藥物模式”。那么，PROTAC究竟是什么？它與傳統(tǒng)藥物有何不同？目前處于什么樣的發(fā)展階段？本文將為你一一解讀。
一、PROTAC
PROTAC，全稱為“蛋白降解靶向嵌合體”，是一種基于細胞內天然蛋白質降解機制的創(chuàng)新型小分子藥物設計策略。
它的結構由三個部分組成：
靶蛋白配體（warhead）：能夠選擇性結合目標蛋白；
E3連接酶配體（ligand）：能結合泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的E3泛素連接酶；
連接臂（linker）：將兩者連接起來。
通過將這兩個配體連接在一起，PROTAC分子能將靶蛋白“送”到細胞的降解機器——泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）中去泛素化降解，從而在系統(tǒng)水平上調控蛋白質的穩(wěn)態(tài)。
圖：基于小分子的PROTAC示意圖
From：Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019;37(1):21-30. doi:10.1002/cbf.3369
迄今為止，已有 30 多種對疾病發(fā)展至關重要的蛋白質成為靶向，其中主要致力于癌癥治療的蛋白質。靶向蛋白包括核受體（ER、AR 和 RAR）、蛋白激酶（Akt、BCR-Abl、c-Abl、BTK、ALK、CDK9、RIPK2、DAPK1 和 PSD-95）、轉錄調控蛋白（BRD4、Sirt2、HDAC6、TRIM24、IKZF1/3 和 Smad3）、調節(jié)蛋白（CRABP-I/II、TACC3、AHR、FKBP12、ERRα 和 X-protein）、神經(jīng)退行性相關蛋白（Huntingtin、Tau、α-synuclein和 PSD-95）、細胞代謝酶（MetAP-2 和 DHODH）、 和融合蛋白（Halo tags）。
圖：靶向蛋白、靶蛋白配體、E3泛素連接酶配體和E3泛素連接酶的總覽
From：Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019;37(1):21-30. doi:10.1002/cbf.3369
二、PROTAC主要優(yōu)勢
傳統(tǒng)小分子藥物的模式是“占位”——它們與靶點結合，抑制其活性。但這通常只適用于“有活性位點”的蛋白，很多被稱為“不可成藥靶點”（undruggable targets）的蛋白，因為缺乏合適結合位點，難以被傳統(tǒng)藥物“拿下”。
而PROTAC則是“破壞”策略。它不需要永久結合目標蛋白，僅需要暫時結合并引導其降解。一旦目標蛋白被降解，PROTAC分子可以“游走”去招募下一個目標。
那么，PROTAC的關鍵優(yōu)勢就有：
- 攻克“不可成藥靶點”：PROTAC可以降解那些難以抑制的蛋白，如轉錄因子、結構蛋白等。
- 持續(xù)時間長、用量低：由于其可重復使用的機制，PROTAC往往具有更持久的藥效。
- 減少耐藥性：傳統(tǒng)抑制劑常因突變產生耐藥性，而PROTAC通過降解可減少這一問題。
- 選擇性更強：通過設計linker和配體結構，PROTAC可以獲得更高的靶點選擇性。
三、PROTAC研發(fā)進展
自PROTAC概念首次提出以來，技術不斷成熟。如今，全球已有多款PROTAC候選藥物進入臨床試驗階段，靶點涵蓋癌癥、炎癥、自身免疫疾病等多個領域。
1．TRD209（SHP2靶向PROTAC降解劑）：
由北京泰德制藥研發(fā)，成功破解“不可成藥”的SHP2靶點，進入藥物開發(fā)階段，對急性髓系白血病（AML）和小細胞肺癌（SCLC）表現(xiàn)出開發(fā)潛力。
2．ARV‑471（雌激素受體降解劑）：
由 Arvinas與輝瑞合作開發(fā)，目前處于 III 期臨床研究，獲FDA快速通道資格，專注治療ER+/HER2−乳腺癌。
3．BMS‑986365（AR靶點）：
Celgene啟動了 III 期臨床試驗，針對去勢抵抗性轉移性前列腺癌（mCRPC），共有約 960例患者參與。
4．ARV‑102（LRRK2靶向降解劑）：
Arvinas發(fā)布首個人體臨床結果，在健康志愿者中安全耐受性良好，有效降低中樞與外周LRRK2水平，為神經(jīng)退行性疾病提供新的療法。
雖然前景廣闊，但PROTAC也面臨不少挑戰(zhàn)：
1. 分子量大、口服性差：PROTAC通常較大，影響口服生物利用度 。
2. 藥代動力學復雜：在體內的穩(wěn)定性、分布等仍需優(yōu)化 。
3. E3連接酶數(shù)量有限：目前常用的E3酶較少（如VHL、CRBN），限制靶點拓展。
4. 免疫原性與安全性：長期降解特定蛋白可能影響正常生理過程 。
“分子膠（molecular glue）”等相關技術也在蓬勃發(fā)展，與PROTAC一起，共同推動新一代“降解型藥物”平臺的興起。不可否認的是，靶向蛋白降解已經(jīng)成為新藥研發(fā)最炙手可熱的方向之一，值得科研界與產業(yè)界持續(xù)關注。
四、TR‑FRET 技術在 PROTAC 研發(fā)中的應用：
TR‑FRET（Time‑Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer）是一種高靈敏的檢測技術，用于檢測PROTAC三元復合物結合。TR‑FRET 可一次性對PROTAC與靶蛋白、E3連接酶結合活性進行評估，無需多個分開試驗，在篩選效率和成本上具備優(yōu)勢。
TR‑FRET 技術應用廣泛，可快速轉至其他靶標（如不同 BRDs）而無需更改 assay 條件，具備良好的模塊化特性。
（一）PROTAC三元復合物結合
以GSPT1/CRBN三元結合為例
CC-885是一種新型的cereblon分子膠調節(jié)劑，它通過與cereblon (CRBN) 結合，利用CRL4CRBN E3泛素連接酶的功能，發(fā)揮抗腫瘤活性。其主要靶點是翻譯終止因子GSPT1，CC-885能夠促進GSPT1的CRBN依賴性泛素化和降解，從而在患者來源的急性髓系白血病腫瘤細胞中表現(xiàn)出高度敏感性，顯示出其臨床潛力。該實驗用Europium-labeled Tag1和Acceptor-labeled Tag2檢測CRBN/DDB1蛋白和GSPT1蛋白通過分子膠CC-885介導的相互作用。
圖左CRBN與GSPT1檢測原理圖；圖右CC-885介導CRBN與GSPT1結合曲線
其他應用實例包括 HDAC10 的 TR‑FRET 配體置換分析，可無需酶促底物，直接評估結合活性，為非傳統(tǒng)靶標提供實驗路徑。
優(yōu)寧維提供HDAC10 ELISA檢測試劑盒（貨號：abs551208-96T），采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被有Histone deacetylase 10 （HDAC10）捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢測抗體，HRP 酶結合物，中間經(jīng)過溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB 在過氧化物酶（HRP）的催化下轉化成藍色并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Histone deacetylase 10 （HDAC10）呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。檢測范圍：78.1-5000pg/mL。
技術原理
THUNDER檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與兩個蛋白結合，產生能量共振轉移FRET（615nm），進而產生665nm熒光信號，熒光信號強度與結合的蛋白濃度成正比，可直接監(jiān)測三元復合物形成，也便于測定結合動力學指標。全程僅需1h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。
使用Bioauxilium 提供的Toolbox試劑進行實驗的可能方案（如下圖），是蛋白質A和蛋白質B之間的相互作用實驗 的一些不同的實驗組合。舉例說明，蛋白質A帶有Tag-a標簽，蛋白質B可以是天然的（圖A），或者將蛋白質B進行生物素化（圖 B），或帶有Tag-b（圖C），或者將蛋白質B直接進行受體或供體標記（圖D）。這幾種示例中，兩種蛋白的標簽或標記都可以互換使用。
圖：蛋白質A和蛋白質B相互作用實驗方案
圖A，使用帶有供體標記的抗標簽a抗體結合蛋白質A，并使用帶有受體標記的抗蛋白質B抗體（定制或用用標記試劑標記）結合蛋白質B，產生FRET信號。
圖B，使用帶有供體標記的抗標簽a抗體結合蛋白質A，用受體標記的鏈霉親和素結合生物素化的蛋白質B產生FRET信號。
圖C，使用帶有供體標記的抗標簽a抗體結合蛋白質A，并使用帶有受體標記的抗Tag-b抗體結合蛋白質B，產生FRET信號。
圖D，使用帶有供體標記的抗標簽a抗體結合蛋白質A，直接將蛋白質B進行受體標記，產生FRET信號。
下游實驗檢測
PROTAC藥物研發(fā)下游實驗涉及細胞因子、磷酸化蛋白的檢測，TR-FRET可以快速篩選潛在候選分子，助力科學實驗。
（1）細胞因子&生物標志檢測
Human IFNγ 為例
THUNDER細胞因子檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的IFNγ抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細胞上清中IFNγ結合，產生能量共振轉移FRET（615nm），進而產生665nm熒光信號，熒光信號強度與IFNγ濃度成正比。全程僅需2h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。
Human IFNγ檢測范圍：32 – 30,000 pg/mL
圖：Human IFNγ檢測原理，流程及標曲
（2）磷酸化蛋白檢測
THUNDER磷酸化蛋白和總蛋白檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的蛋白抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細胞上清中目標蛋白結合，產生能量共振轉移FRET（615nm），進而產生665nm熒光信號，熒光信號強度與目標蛋白濃度成正比。以磷酸化ERK為例，全程僅需4.5h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。
圖3. THUNDER磷酸化蛋白檢測原理示意圖
該試劑盒已通過驗證，適用于HEK293、H358、MCF7和B淋巴細胞裂解液中磷酸化- ERK1 /2（T202/Y204）的相對定量。用EGF處理HEK293細胞（50000個細胞/孔）與不同梯度濃度的EGF在室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，EGF促進ERK磷酸化。饑餓處理不同密度的H358細胞18個小時，用不同梯度濃度的RMC-4550在37℃下孵育60分鐘。數(shù)據(jù)顯示，RMC-4550可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點的磷酸化。用不同梯度濃度的L779,450處理不同密度的MCF7細胞，在37℃下孵育30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點的磷酸化。在不含血清的RPMI中重懸不同密度的B淋巴細胞，用不同梯度濃度的L779,450在室溫下孵育30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點的磷酸化。
圖. THUNDER Extreme Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)驗證數(shù)據(jù)
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