文章分享：由STYK1驅動的胰腺癌進展新機制和治療新靶點研究
Wnt/β-catenin信號通路是一條在胚胎發(fā)育、干細胞穩(wěn)態(tài)、組織再生及腫瘤發(fā)生中高度保守的信號通路，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。在胰腺癌中Wnt/β-catenin信號通路持續(xù)激活，導致不良預后以及癌癥相關死亡率升高，推動腫瘤的快速發(fā)展。Wnt/β-catenin信號通路通路為何失控加速，持續(xù)激活？近日，湖北工業(yè)大學唐景峰教授團隊發(fā)表在Signal Transduction and Targeted Therapy的文章揭示了其內在機制。
在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)了一個重要的靶標STYK1，并探究了STYK1在調控經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路及胰腺癌腫瘤發(fā)生中的作用。研究結果表明，STYK1可直接與β-catenin和GSK3β結合，抑制GSK3β的活性，并促進其進入多囊泡體（MVBs）中。BLK激酶對STYK1的Y191位點磷酸化，增強其與AP2的相互作用，從而加速GSK3β隔離至MBVs，使其失去對β-catenin的抑制作用，并隨后激活Wnt/β-catenin通路。這些結果共同揭示了在胰腺癌中一種由STYK1驅動的Wnt/β-catenin激活的新機制，并為將STYK1介導的信號轉導作為治療策略提供了臨床前證據(jù)。
文章總體思路
作者的研究思路如下：
首先研究團隊通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)STYK1在多種人類癌癥中普遍高表達，在胰腺癌中尤為顯著。通過對多個公共數(shù)據(jù)庫，患者胰腺癌組織微陣列，PDAC模型小鼠進一步分析，表明STYK1的表達水平與PDAC（胰腺導管腺癌）的進展平行階段性增強。在小鼠腫瘤異種移植瘤模型中敲除STYK1后，腫瘤生長相較于對照組明顯減弱。
Fig 1. SRYK1在胰腺癌組織中表達上調，STYK1敲除減緩胰腺癌進程
為了深入闡明STYK1在胰腺癌腫瘤發(fā)生中的分子機制，作者對穩(wěn)定轉染STYK1 shRNA的胰腺癌細胞進行全基因組RNA測序�；虮倔w（Gene Ontology)富集分析顯示，STYK1的缺失會改變Wnt/β-catenin信號通路的調控，而這一通路被認為與胰腺癌的進展密切相關。在AsPC-1和PANC-1這兩種胰腺導管腺癌（PDAC）模型中，TOPflash/FOPflash雙熒光素酶報告實驗顯示，STYK1缺失可顯著抑制β-catenin的基礎轉錄活性以及Wnt3a刺激所誘導的轉錄激活。而STYK1過表達可增強β-catenin在核內的積累。這些結果表明，STYK1通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路進而調節(jié)胰腺癌進展。
Fig.2 STYK1促進Wnt/β-catenin信號通路激活
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為了進一步探討STYK1在調控Wnt/β-catenin信號通路中的機制，作者構建表達STYK1相關蛋白復合物進行親和純化。隨后通過LC-MS/MS分析，鑒定出GSK3β和β-catenin為主要相互作用蛋白，表明STYK1通過調節(jié)β-catenin降解復合體的活性參與Wnt/β-catenin信號通路的調控。通過CO-IP，免疫熒光，GST-pull down等多重驗證，結果均表明STYK1和GSK3β、β-catenin有相互作用。CHX追蹤實驗表明STYK1過表達顯著抑制β-catenin的降解。
Fig.3 STYK1和GSK3β、β-catenin具有相互作用
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接下里，作者進一步研究STYK1和GSK3β、β-catenin之間的作用機理。先前的研究發(fā)現(xiàn)，STYK1 部分定位于細胞膜，胞內部分則與 Rab5 或 Rab7 陽性（Rab5⁺/Rab7⁺）多囊泡體（MVBs）共定位，而這些MVBs與 GSK3β 的隔離有關。因此，作者猜測STYK1會影響MVBs對GSK3β 的隔離。因此，作者構建了一個Rab5 Q79L突變體以誘導形成擴大的晚期內體囊腔，并分析了Rab5 Q79L表達細胞中GSK3β的亞細胞分布。結果表明，Wnt3a會顯著促進GSK3β進入MVBs中，而STYK1的缺失會逆轉這一過程。
Fig.4 Wnt3a會顯著促進GSK3β進入MVBs中，而STYK1的缺失會逆轉這一過程。
為探究 STYK1-β-catenin 或 STYK1-GSK3β 相互作用在 GSK3β 隔離及其后續(xù) Wnt/β-catenin 信號傳導中的作用，作者設計了能夠特異性破壞 STYK1 與 β-catenin 或GSK3β 結合的短肽，并通過Biacore實驗驗證其效果。接下來，作者檢測這些短肽對于GSK3β以及Wnt/β-catenin信號通路的影響。結果表明，這些短肽抑制GSK3β進入MVBs，并促進了GSK3β, Axin1, and β-catenin之間的相互作用以及隨后β-catenin的降解。這些結果表明，STYK1 -β-catenin或STYK1-GSK3β相互作用對于STYK1介導的GSK3β隔離和隨后的Wnt/β-catenin信號傳導激活至關重要。進一步的研究也表明這些阻斷肽會抑制移植瘤的生長，增加腫瘤異種移植瘤小鼠的生存期。
Fig.5 活性短肽抑制GSK3β進入MVBs，并促進了GSK3β, Axin1, and β-catenin之間的相互作用以及隨后β-catenin的降解。
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綜上，作者通過多種體外和體內實驗，發(fā)現(xiàn)STYK1的高表達與胰腺癌生存率低有關，并且
STYK1缺失抑制胰腺癌細胞的生長。此外，作者還闡明了STYK1通過與GSK3β和β-catenin結合來激活Wnt/β-catenin信號傳導的作用。clathrin/ AP2介導的STYK1內化和GSK3β隔離在β-catenin復合體的失活和隨后的Wnt/β-catenin信號傳導中發(fā)揮了重要作用。
在疾病機制研究中，蛋白作為生命活動的關鍵分子，其功能和相互作用在疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演者重要的作用。因此，深入研究蛋白質的結構和功能，對于揭示疾病發(fā)生，通路機制以及研發(fā)有效的治療策略具有重要的意義。在這一過程中，蛋白純化是不可或缺的關鍵步驟。掌握成熟的純化方法并得到足量的高純度高活性的蛋白，無論是對于蛋白功能，相互作用，或者蛋白結構研究都非常重要。
以本文的STYK1蛋白純化方法為例，原核表達體系蛋白純化可以按照以下的步驟進行（具體操作視頻點擊查看https://www.univ-bio.com/study-center/solution/Technology/PPP.html）：
1、質粒構建
在NCBI上查找STYK1 ICD序列（aa 26-422），設計引物PCR擴增目標基因片段；將目標片段和克隆載體pGEX4T-1（如果是His標簽，可以選擇pET-28a克隆載體）分別使用限制性內切酶進行酶切，并使用T4連接酶進行連接。
構建好的重組質粒轉入E.coli TOP 10感受態(tài)細胞進行質粒擴增和鑒定，鑒定后的重組質粒轉入E. coli strain BL21 (DE3)進行表達。
2、蛋白表達
包含重組質粒的E. coli strain BL21 (DE3)菌株接種到5ml包含70 μg/ml ampicillin的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)。過夜的培養(yǎng)基接種到50ml包含70 μg/ml ampicillin(diluted 1:100)的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600 =0.4–0.6。
加入0.2 mM IPTG進行誘導表達37℃，5h。大腸桿菌菌體通過離心收集（12,000g for 3 min），細胞沉淀用裂解液進行重懸，然后冰上超聲100次（sonicated 5 s with 5 s intervals between each pulse）。
30,000g 離心30 min，取上清用0.45μm濾膜過濾。
3、蛋白純化
GST標簽：
結合緩沖液：PBS, pH7.3
洗脫緩沖液：50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione,pH 8.0
His標簽：
結合緩沖液：20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl，20 to 40 mM imidazole, pH 7.4
洗脫緩沖液：20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4
潤洗濾膜并放入重力空柱中，加入1ml GST填料用結合緩沖液平衡3次。加入2ml結合緩沖液到填料中重懸制備填料懸液，然后將樣品和填料懸液混合，并放入離心管中搖晃孵育1-2h。
將樣品和填料懸液混合物倒入層析空柱，將層析柱豎直放置在試管架上。加入5ml結合緩沖液洗雜。
加入3-5ml洗脫緩沖液進行目標蛋白洗脫，收集流出液。收集物使用SDS-PAGE跑膠鑒定。
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