自體體外、通用體外和體內(nèi)CAR工程化免疫細胞療法的區(qū)別對比

文章來源公眾號：藥啟程            作者：phoebe

簡介
嵌合抗原受體（CAR）工程化免疫細胞療法代表了癌癥治療領域的一項重大進展。然而，復雜的體外細胞制備流程和嚴格的患者篩選標準限制了其廣泛應用。

體內(nèi)CAR工程正成為一種前景廣闊的“即用型”治療策略，具備簡化生產(chǎn)、免除患者個體化制備、降低成本并簡化供應鏈等多重優(yōu)勢。大量臨床前研究激發(fā)了針對實體瘤等難治疾病的深入探索，并推動了旨在提升體內(nèi)CAR工程療效、細胞治療持久性及安全性的新一代產(chǎn)品開發(fā)。

一、3種方式對比（自體體外、通用體外和體內(nèi)）
（1）所有已上市的 CAR-T 產(chǎn)品均基于自體 T 細胞的體外工程：先從患者體內(nèi)分離 T 細胞，再用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒將 CAR 基因?qū)�入其中；隨后給予淋巴細胞清除預處理，使工程細胞獲得穩(wěn)態(tài)優(yōu)勢（減少與內(nèi)源免疫細胞的競爭，并清除可能抑制 CAR-T 功能的調(diào)節(jié)性 T 細胞，從而增強其存活、擴增及抗腫瘤效力）；最后將改造后的細胞回輸同一患者（圖 1a）。這種“一人一藥”的個性化制造模式復雜且昂貴，難以像常規(guī)藥品那樣批量生產(chǎn)，成為推廣應用的主要障礙。

（2）為克服自體 CAR-T 的生產(chǎn)難題，多種策略已被提出。其中最具前景的是“即用型”同種異體 CAR 工程細胞產(chǎn)品：從健康供者獲取細胞，經(jīng)工程改造后制成可凍存的通用庫存（圖 1b）。其優(yōu)點包括產(chǎn)品可立即使用、制造工藝標準化、細胞改造時間充裕，并通過工業(yè)化流程降低成本。然而，同種異體CAR-T存在致命的移植物抗宿主�。℅vHD）風險。雖然已有緩解策略在開發(fā)，但仍需淋巴細胞清除以防止宿主排斥，而清淋常伴隨長期血細胞減少、中性粒細胞缺乏及反復感染。因此，亟需全新策略，在保持高效殺瘤活性的同時降低制造復雜度和成本。

（3）直接在患者體內(nèi)生成CAR-T細胞（即“體內(nèi)CAR工程”）被視為解決上述難題的潛在突破口（表 1，圖 1c）。這種即用型產(chǎn)品可在受者體內(nèi)即時產(chǎn)生CAR免疫細胞，省去個體化制造，簡化物流，顯著降低成本并縮短治療等待時間。此外，采用非整合載體的體內(nèi)方法或可避免體外永久基因修飾所帶來的T細胞耗竭與安全隱患。

二、體內(nèi)CAR不同方式對比
（1）LNP包裹的核酸
裝載mRNA的LNP（LNP–mRNA）技術(shù)依托一套成熟的大規(guī)模臨床生產(chǎn)體系，這一點已由冠狀病毒�。–OVID-19）疫苗的成功量產(chǎn)所證明。FDA的批準也進一步確認了其安全性，并凸顯了其在更廣泛治療場景中的潛力，例如體內(nèi)CAR工程。

給藥后，LNP–mRNA 會被多種細胞攝取，特別是靜脈注射時主要由肝細胞內(nèi)吞。進入細胞后，mRNA從晚期內(nèi)體逃逸至胞質(zhì)，短暫翻譯后隨即降解。在LNP表面偶聯(lián)抗體可使其被特定細胞類型選擇性攝取。

由于mRNA僅停留在胞質(zhì)，本身不穩(wěn)定，不能整合進基因組，且在細胞分裂過程中會被稀釋，因此基于LNP–mRNA 的工程化方案天然是“一過性”的。這意味著，若想在體內(nèi)持續(xù)維持CAR表達的治療效果，就必須頻繁、重復給藥。

臨床前研究表明，利用 LNP–mRNA 技術(shù)在體生成 CAR-T細胞在癌癥免疫治療中具有巨大前景（圖 2a）。如此生成的 CAR-T 細胞因其“短暫存在”而有望降低潛在毒性，并允許精準劑量控制；同時無需在注射前進行淋巴細胞清除。

圖 2 | T 細胞體內(nèi) CAR 工程的現(xiàn)有策略及作用機制

目前多數(shù)借助 LNP 在體內(nèi)制備 CAR-T 細胞的研究，均在納米顆粒中摻入可識別 CD3、CD4、CD5、CD7 或 CD8 的抗體或單鏈可變片段（scFv）。

抗體標記的 LNP（以及后文將討論的聚合物納米顆粒）具有獨特的藥代動力學/藥效學（PK/PD）特征。靜脈注射 4 小時后，非靶向納米顆粒主要被肝臟攝取，而經(jīng)CD3或CD8抗體修飾的淋巴細胞靶向納米載體則優(yōu)先富集于富含 T 細胞的組織，如脾臟、淋巴結(jié)和骨髓。然而，在LNP表面偶聯(lián)靶向配體會使制造工藝復雜化，降低產(chǎn)率和穩(wěn)定性，且產(chǎn)品無法長期冷凍保存。

（2）LNP 或聚合物封裝核酸
陽離子可降解聚(β-氨基酯)（PBAE）聚合物制劑可通過靜電作用與帶負電的核酸（DNA 或 mRNA）自組裝，并在內(nèi)吞后依賴pH變化實現(xiàn)內(nèi)體逃逸。研究人員進一步將這些聚合物與含有微管相關序列和核定位信號的肽段偶聯(lián)，借助微管運輸機制加速遺傳貨物入核。

PBAE聚合物納米顆�？缮�物降解，在人源化小鼠體內(nèi)循環(huán)半衰期僅1–7小時；動物實驗表明，即使高劑量顱內(nèi)給藥也未見毒性。其制備可采用納米沉淀、乳液聚合或溶劑揮發(fā)等成熟工藝，且可通過凍干制成干粉，便于儲存、提高穩(wěn)定性并降低成本。臨床前模型已證實，PBAE納米顆粒可用于體內(nèi)T細胞基因工程（圖 2b）及體外巨噬細胞基因工程。

為實現(xiàn)對 T 細胞的特異性遞送，研究者將聚谷氨酸與抗 CD8 或抗 CD3 抗體偶聯(lián)，該復合物再通過靜電作用吸附于 PBAE 顆粒表面。隨后，這些靶向納米顆�？裳b載： 
• 質(zhì)粒 DNA（可設計為整合或非整合型）； 
• 轉(zhuǎn)座子DNA（可將構(gòu)建體整合到安全港位點26,27）； 
• 編碼CAR的mRNA。

綜上，PBAE聚合物納米顆粒制備簡單、穩(wěn)定性高，便于儲存且成本較低，為體內(nèi)誘導 CAR-T 細胞免疫提供了可行、靈活且適用范圍廣的解決方案。然而，與LNP相比，后者在包封效率、抗降解保護及臨床 mRNA疫苗應用中已建立的安全性方面更具優(yōu)勢，但PBAE納米顆粒仍需就規(guī)�；�生產(chǎn)、長期生物相容性及潛在毒性進行深入研究。

（3）慢病毒遞送系統(tǒng)
慢病毒是一類具有球形包膜、單股RNA基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒亞型，因其能將外源基因整合到宿主基因組中，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的長期表達。慢病毒載體已被廣泛用于向T細胞遞送外源基因。然而，其在體內(nèi)的感染效率常受限于病毒本身對靶細胞的低親和力以及T細胞通常處于靜息狀態(tài)。為提高其體內(nèi)T細胞轉(zhuǎn)導效率，研究者采用了多種病毒包膜進行假型化，包括尼帕病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒以及 cocal 融合糖蛋白等。此外，慢病毒還可通過將單鏈抗體（scFv）或設計的錨蛋白重復蛋白（DARPins）與病毒表面的糖蛋白復合體基因融合，實現(xiàn)對特定 T 細胞亞群的靶向感染（圖 2c）。

慢病毒已被廣泛用于體外治療應用，其臨床級生產(chǎn)工藝及試劑已成熟，可實現(xiàn) CAR 轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合與表達。然而，當用于體內(nèi)時，病毒永久整合帶來的安全性顧慮顯著升高，包括可控整合、潛在非預期突變及長期風險等問題。因此，體內(nèi)應用慢病毒載體需對靶細胞類型實施嚴格控制，且僅在經(jīng)過嚴格安全性評估后才可能進入臨床試驗并最終獲批。

（4）基于 AAV 的遞送系統(tǒng)
腺相關病毒（AAV）是一種無包膜的小病毒，具有二十面體衣殼結(jié)構(gòu)和單鏈DNA基因組，不會整合到宿主基因組中。其衣殼可被工程化改造，以展示scFv、DARPins等多種蛋白；這些衣殼修飾對于實現(xiàn)特定細胞靶向、減少非特異性攝取至關重要。

憑借長期轉(zhuǎn)基因表達、表型糾正能力強且毒性低等優(yōu)勢，AAV已成為治療性基因遞送的關鍵載體。與慢病毒相比，AAV DNA以穩(wěn)定的附加體形式存在，可抵抗外切酶降解，并利用宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成脫殼。這種穩(wěn)定性及附加體持久存在特性，使AAV成為體內(nèi)基因操作的理想載體，且不帶來插入突變風險。然而，AAV編碼的CD4靶向CAR在記憶T細胞中長期存在，可能加劇CD4⁺ T細胞缺乏，因此在臨床應用中必須配備有效的安全開關。

（5）生物指令可植入支架
將病毒載體預載入可植入多功能海藻酸支架，實現(xiàn)體內(nèi)CAR-T細胞的工程化與釋放，是“體內(nèi)”與“體外”策略的混合方案。其仍需先自患者分離T細胞，但處理時間縮短至一天。不同于其他體內(nèi)工程方法，海藻酸支架提供了一個局部、可控的微環(huán)境，增強 T 細胞與病毒載體、細胞因子、趨化因子之間的相互作用。通過空間局限化，可提升CAR轉(zhuǎn)導效率，并減少全身工程化帶來的潛在副作用（圖 2d）。

（6）Cas9 包膜遞送載體（Cas9-EDVs）
病毒或病毒衍生顆粒在體內(nèi)基因工程中可能因非靶細胞的意外轉(zhuǎn)導而產(chǎn)生脫靶效應，這是重大局限。

為此，研究者開發(fā)了一種技術(shù)：利用可預測的抗體–抗原相互作用，將基因組編輯機器瞬時、精準地遞送至目標細胞，從而在預設基因組位點實現(xiàn)精確且永久的基因編輯，同時最大限度減少對旁觀細胞的脫靶影響。

（7）病毒擬態(tài)融合納米囊泡（FuNVs）
預制的CAR蛋白亦可直接插入T細胞膜內(nèi)。該方法使CAR蛋白僅存在有限時間，從而降低持續(xù)CAR 介導 T細胞活化引發(fā)的細胞因子釋放綜合征（CRS）風險，且不存在插入突變可能。

研究者借助病毒擬態(tài)FuNVs實現(xiàn)工程蛋白的直接插入。FuNVs整合了T細胞融合原—抗人CD3 scFv，以及如CD19 CAR的CAR蛋白（圖 2f）。

三、體內(nèi)和體外工程對比
體內(nèi)或體外每種途徑各有優(yōu)勢，也面臨獨特挑戰(zhàn)，涉及生產(chǎn)物流、療效及安全/毒性考量（表 3）。以下從三方面系統(tǒng)比較。

一、物流與制造
體外自體 CAR-T：生產(chǎn)時間長、規(guī)�；�難、成本高
體外異體 CAR-T：現(xiàn)貨供應、可規(guī)模放大，成本低于自體產(chǎn)品。
體內(nèi) CAR-T：“現(xiàn)貨”+“自體”雙重屬性：簡化放行檢測、縮短供應鏈，降低成本與周期。
     
二、療效
體外自體 CAR-T:對血液瘤成功，對實體瘤療效有限;回輸前需淋巴清除，導致免疫抑制；單靶點易逃逸；回輸前體外長期激活可致耗竭。

體內(nèi) CAR-T
 • 在 TME 內(nèi)持續(xù)編輯與擴增，克服遷移與持久性不足。
 • 可多靶點（多 mRNA 或病毒）或序貫給藥，降低逃逸風險。
 • 無淋巴清除，保留免疫系統(tǒng)完整性，促進表位擴散。
 • 可與 siRNA、細胞因子 mRNA 聯(lián)合，動態(tài)調(diào)節(jié) TME。
 • 初期 CAR⁺ 細胞數(shù)量少，需體內(nèi)擴增，或延遲起效；腫瘤患者 T 細胞數(shù)量/功能受損時療效受限。
 • 體內(nèi)分布、遷移、PK/PD 復雜；非整合載體表達短暫；整合載體需權(quán)衡插入突變風險。

三、安全與毒性
體外 CAR-T:需淋巴清除化療，帶來相應毒性;CRS/ICAN;慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒整合存在插入突變風險。

體內(nèi) CAR-T:無需淋巴清除，避免相關毒性;非整合載體（mRNA等）無插入突變，可隨時調(diào)整劑量，降低 CRS/ICAN;脫靶遞送可能導致非目標細胞異常 CAR 表達，需精準靶向以避免生殖細胞轉(zhuǎn)導。目前更傾向使用非整合或位點特異性整合載體。

四、展望
與現(xiàn)有的體外制備自體 CAR-T 細胞相比，體內(nèi) CAR 工程技術(shù)在治療癌癥等疾病時兼具經(jīng)濟與物流優(yōu)勢：可作為“即用型”產(chǎn)品，卻仍能在患者體內(nèi)生成個體化工程細胞，并省去淋巴細胞清除等預處理步驟。簡化的生產(chǎn)流程有望為罹患多種疾病的數(shù)百萬患者提供切實可行、可規(guī)�；�的治療手段。

然而，這些研究僅限于同系或人源化小鼠模型。要在人類中確立體內(nèi) CAR 工程的可行性、療效與安全性，有待開展臨床試驗驗證。體內(nèi) CAR 療法的臨床試驗必須慎思倫理問題，尤其當 FDA 已批準的自體 CAR-T 成為標準治療時。確保信息透明與知情同意，充分告知潛在風險、獲益及不確定性，是倫理實踐的核心�？赡艿呐R床應用場景包括：難治性癌癥、復發(fā)/難治且選擇有限的患者，以及在高度監(jiān)管的專業(yè)中心開展的先導研究。適應性試驗設計可在這些情境下迭代優(yōu)化安全性、療效與可行性評估，為更廣泛應用奠定基礎。

在各類體內(nèi) CAR 工程平臺中，基于 LNP-mRNA 的 CAR 最具率先進入臨床的潛力，其瞬時表達特性雖可能限制長期 CAR 存在，卻有利于降低毒性并允許無基因組整合風險的再次給藥。相比之下，慢病毒載體因插入突變和脫靶整合顧慮而障礙較大，除非開發(fā)出更安全的定點整合策略。

總體而言，體內(nèi) CAR 工程領域方興未艾，有望帶來醫(yī)學治療的重大飛躍。要將其確立為新治療范式，需要科學家、臨床醫(yī)師與生物技術(shù)公司緊密合作，共同解決懸而未決的問題，并在療效與安全性之間持續(xù)優(yōu)化載體設計。