基質(zhì)金屬蛋白酶MMP的結(jié)構(gòu)、分類及WB檢測注意事項
MMP
MMP全稱為Matrix Metalloproteinases，基質(zhì)金屬蛋白酶。MMPs最初被認為是作用于細胞外基質(zhì)（ECM）的一組蛋白酶，然而之后許多研究發(fā)現(xiàn)它的底物更多是非細胞外基質(zhì)蛋白，這部分占比達到了69%。由于作用底物的多樣性，MMPs參與了許多與自身穩(wěn)定相關(guān)的功能，例如組織修復、免疫及病理過程，包括腫瘤、纖維化和感染。
結(jié)構(gòu)與分類
MMP的結(jié)構(gòu)主要有三個結(jié)構(gòu)域，即前肽（Propeptide）、催化結(jié)構(gòu)域（Catalytic domain）以及血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域（Hemopexin domain），如下圖所示：
圖1 MMP的結(jié)構(gòu)域
MMP又可以根據(jù)結(jié)構(gòu)域的差異和底物特異性進行細分，如下圖所示。研究比較多的MMP2和MMP9之前被稱為明膠酶A和B，因為它們能夠裂解變性的膠原蛋白或明膠。
圖2 MMP的分類
酶活
MMP是一種蛋白酶，那我們必須得提提它的酶活。MMP首先在體內(nèi)合成酶原前體，并不具有酶活。因為前肽結(jié)構(gòu)域內(nèi)的半胱氨酸殘基與催化域內(nèi)的鋅離子形成了絡合物，從而防止酶活性。只有打開這個半胱氨酸開關(guān)，才能釋放酶活性位點，使其和底物相互作用。
圖3 MMP激活過程
上圖中B亞型前肽沒有完全去除，仍然連接在一起，也具有部分催化活性。C是前肽完全去除，具有最大的催化活性，也就是我們研究最多的活性MMP。
檢測方法
因為MMP亞型較多，所以我們在檢測時一定要考慮清楚自己想要檢測的哪部分，哪部分才是和自己課題最關(guān)系密切的。因為很多MMP蛋白的直接測量不會區(qū)分活性酶和非活性酶。
不同的檢測方法所觀察的亞型是不同的：
❖IHC：可以觀察MMP的表達量和表達位置，但是無法區(qū)分是Latent MMP還是active MMP。
❖底物（明膠）酶譜法：檢測MMP活性常用的實驗方法，可以清楚觀察到有活性的MMP和proMMP。有一個問題是，TIMP可能在實驗過程中與MMP解離，導致有活性的MMP比樣本實際要多。
❖ELISA：檢測到的主要是active MMP。
❖WB：使用的抗體可以識別圖3的3種亞型，并且可以通過分子量來區(qū)別。缺點和酶譜法類似。
WB作為MMP主流的檢測方法之一,需要注意什么呢？
01 樣本表達量
大多數(shù)MMPs不是組成型表達，就是本底表達水平是比較低的，極少被儲存。大多數(shù)細胞需要被激活才能表達MMPs，而且新產(chǎn)生的MMPs以酶原無活性形式存在。所以我們在選擇研究對象時一定要充分考慮表達量，可以通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫或者參考文獻以及預實驗的結(jié)果，來確定樣本中的表達量。
有小伙伴說，MMP在癌癥中高表達，那我選擇一種做不就行了？確實，MMP在很多癌癥中是高表達的，而且作為預后觀測的一個重要指標，但是并不是每種癌癥或者癌細胞系都是高表達的。下圖是HPA中各種癌癥的表達量，差異還是非常大的。
圖4 MMP9在癌癥中表達情況
02 表達位置
MMP會分泌至細胞外，很多小伙伴應該都清楚，所以在做細胞樣本時需要收集培養(yǎng)基進行檢測。而且很多時候光收集培養(yǎng)基還不夠，因為濃度太低也不容易檢測，還需要進一步濃縮培養(yǎng)基。
如何濃縮呢？下圖CST廠家在檢測MMP9時使用的是超濾管，將無血清培養(yǎng)基進行濃縮之后再檢測。當然，如果做的是組織樣本，就沒有這種煩惱了。
圖5 MMP9使用濃縮培養(yǎng)基檢測結(jié)果
除了分泌的MMP，一些研究還發(fā)現(xiàn)，分泌出去的MMP還會通過內(nèi)吞作用回到細胞內(nèi)，有的還會進入細胞核發(fā)揮功能。所以我們在檢測的時候，千萬不要只留了培養(yǎng)基，細胞沉淀就扔掉了，可以一起檢測比對下。
圖6 MMP在不同細胞中表達位置
03 需要同時檢測TIMP
TIMP是MMP的內(nèi)源抑制劑，我們?yōu)槭裁匆瞿兀繌膱D3可以看出， MMP的3個亞型理論上都可以被抗體檢測到，而且由于這些亞型具有不同的分子量，我們是可以區(qū)別并且統(tǒng)計酶活的變化。但是有一點，就是MMP–TIMP復合物在電泳過程中是有可能解離的，因此，小分子量條帶可能不能準確地代表內(nèi)源性活性。如果這個時候，我們有了TIMP的WB結(jié)果，可以側(cè)面幫助解決這個疑問。
圖7 文獻中MMP和TIMP搭檔出現(xiàn)
最后，再強調(diào)一句做MMP的WB之前，我們一定要做好充分的準備工作。準備研究的亞型，活性評估，研究對象，表達位置等等，只有弄清楚了這些問題再入手去做才能事半功倍。
部分相關(guān)產(chǎn)品：
參考文獻：
Jones, G. T. (2014). Matrix Metalloproteinases in Biologic Samples. Advances in Clinical Chemistry, 199–219. doi:10.1016/b978-0-12-800141-7.00007-3
Luiz G N de Almeida.Matrix Metalloproteinases: From Molecular Mechanisms to Physiology, Pathophysiology, and Pharmacology.PMID: 35738680 DOI: 10.1124/pharmrev.121.000349
MMP全稱為Matrix Metalloproteinases，基質(zhì)金屬蛋白酶。MMPs最初被認為是作用于細胞外基質(zhì)（ECM）的一組蛋白酶，然而之后許多研究發(fā)現(xiàn)它的底物更多是非細胞外基質(zhì)蛋白，這部分占比達到了69%。由于作用底物的多樣性，MMPs參與了許多與自身穩(wěn)定相關(guān)的功能，例如組織修復、免疫及病理過程，包括腫瘤、纖維化和感染。
結(jié)構(gòu)與分類
MMP的結(jié)構(gòu)主要有三個結(jié)構(gòu)域，即前肽（Propeptide）、催化結(jié)構(gòu)域（Catalytic domain）以及血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域（Hemopexin domain），如下圖所示：
圖1 MMP的結(jié)構(gòu)域
MMP又可以根據(jù)結(jié)構(gòu)域的差異和底物特異性進行細分，如下圖所示。研究比較多的MMP2和MMP9之前被稱為明膠酶A和B，因為它們能夠裂解變性的膠原蛋白或明膠。
圖2 MMP的分類
酶活
MMP是一種蛋白酶，那我們必須得提提它的酶活。MMP首先在體內(nèi)合成酶原前體，并不具有酶活。因為前肽結(jié)構(gòu)域內(nèi)的半胱氨酸殘基與催化域內(nèi)的鋅離子形成了絡合物，從而防止酶活性。只有打開這個半胱氨酸開關(guān)，才能釋放酶活性位點，使其和底物相互作用。
圖3 MMP激活過程
上圖中B亞型前肽沒有完全去除，仍然連接在一起，也具有部分催化活性。C是前肽完全去除，具有最大的催化活性，也就是我們研究最多的活性MMP。
檢測方法
因為MMP亞型較多，所以我們在檢測時一定要考慮清楚自己想要檢測的哪部分，哪部分才是和自己課題最關(guān)系密切的。因為很多MMP蛋白的直接測量不會區(qū)分活性酶和非活性酶。
不同的檢測方法所觀察的亞型是不同的：
❖IHC：可以觀察MMP的表達量和表達位置，但是無法區(qū)分是Latent MMP還是active MMP。
❖底物（明膠）酶譜法：檢測MMP活性常用的實驗方法，可以清楚觀察到有活性的MMP和proMMP。有一個問題是，TIMP可能在實驗過程中與MMP解離，導致有活性的MMP比樣本實際要多。
❖ELISA：檢測到的主要是active MMP。
❖WB：使用的抗體可以識別圖3的3種亞型，并且可以通過分子量來區(qū)別。缺點和酶譜法類似。
WB作為MMP主流的檢測方法之一,需要注意什么呢？
01 樣本表達量
大多數(shù)MMPs不是組成型表達，就是本底表達水平是比較低的，極少被儲存。大多數(shù)細胞需要被激活才能表達MMPs，而且新產(chǎn)生的MMPs以酶原無活性形式存在。所以我們在選擇研究對象時一定要充分考慮表達量，可以通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫或者參考文獻以及預實驗的結(jié)果，來確定樣本中的表達量。
有小伙伴說，MMP在癌癥中高表達，那我選擇一種做不就行了？確實，MMP在很多癌癥中是高表達的，而且作為預后觀測的一個重要指標，但是并不是每種癌癥或者癌細胞系都是高表達的。下圖是HPA中各種癌癥的表達量，差異還是非常大的。
圖4 MMP9在癌癥中表達情況
02 表達位置
MMP會分泌至細胞外，很多小伙伴應該都清楚，所以在做細胞樣本時需要收集培養(yǎng)基進行檢測。而且很多時候光收集培養(yǎng)基還不夠，因為濃度太低也不容易檢測，還需要進一步濃縮培養(yǎng)基。
如何濃縮呢？下圖CST廠家在檢測MMP9時使用的是超濾管，將無血清培養(yǎng)基進行濃縮之后再檢測。當然，如果做的是組織樣本，就沒有這種煩惱了。
圖5 MMP9使用濃縮培養(yǎng)基檢測結(jié)果
除了分泌的MMP，一些研究還發(fā)現(xiàn)，分泌出去的MMP還會通過內(nèi)吞作用回到細胞內(nèi)，有的還會進入細胞核發(fā)揮功能。所以我們在檢測的時候，千萬不要只留了培養(yǎng)基，細胞沉淀就扔掉了，可以一起檢測比對下。
圖6 MMP在不同細胞中表達位置
03 需要同時檢測TIMP
TIMP是MMP的內(nèi)源抑制劑，我們?yōu)槭裁匆瞿兀繌膱D3可以看出， MMP的3個亞型理論上都可以被抗體檢測到，而且由于這些亞型具有不同的分子量，我們是可以區(qū)別并且統(tǒng)計酶活的變化。但是有一點，就是MMP–TIMP復合物在電泳過程中是有可能解離的，因此，小分子量條帶可能不能準確地代表內(nèi)源性活性。如果這個時候，我們有了TIMP的WB結(jié)果，可以側(cè)面幫助解決這個疑問。
圖7 文獻中MMP和TIMP搭檔出現(xiàn)
最后，再強調(diào)一句做MMP的WB之前，我們一定要做好充分的準備工作。準備研究的亞型，活性評估，研究對象，表達位置等等，只有弄清楚了這些問題再入手去做才能事半功倍。
部分相關(guān)產(chǎn)品：
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名稱 |
貨號 |
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MMP-9 (D6O3H) XP Rabbit mAb |
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MMP-9 Antibody |
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MMP-2 (D4M2N) Rabbit mAb |
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MMP-2 Antibody |
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MMP9 Rabbit mAb |
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MMP2 Rabbit mAb |
參考文獻：
Jones, G. T. (2014). Matrix Metalloproteinases in Biologic Samples. Advances in Clinical Chemistry, 199–219. doi:10.1016/b978-0-12-800141-7.00007-3
Luiz G N de Almeida.Matrix Metalloproteinases: From Molecular Mechanisms to Physiology, Pathophysiology, and Pharmacology.PMID: 35738680 DOI: 10.1124/pharmrev.121.000349
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