PD-L1的發(fā)現(xiàn)、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及做出漂亮WB條帶的方法
PD-L1
全名叫程序性細(xì)胞死亡蛋白 1 配體 1(Programmed cell death 1 ligand 1)，也稱為表面抗原分化簇274(Cluster of differentiation 274，CD274)或 B7同源體1(B7 homolog 1，B7-H1)，由CD274基因編碼，是細(xì)胞表面配體 B7 家族的一員。那么它是怎么被發(fā)現(xiàn)的呢？
其實(shí)首先發(fā)現(xiàn)的是PD-1。1992 年 Y·Ishida 及其團(tuán)隊(duì)在研究細(xì)胞凋亡過程中發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫環(huán)境內(nèi)還存在一種特殊受體，并將這種抑制T細(xì)胞免疫活性的分子命名為細(xì)胞程序性死亡受體（programmed cell death protein 1，PD-1，CD279）。2000年 Y·Ishida 聯(lián)合哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院丹娜法伯癌癥研究院共同發(fā)表了以 PD-1 腫瘤免疫理論為基礎(chǔ)的重要論文，繼抑制T細(xì)胞免疫活性的受體分子后又發(fā)現(xiàn)B7蛋白家族配體細(xì)胞程序性死亡配體1，闡述了 PD-1 /PD-L1 參與調(diào)控 T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用過程。
從此，PD-1/PD-L1信號(hào)通路便一發(fā)“不可收拾”，成為研究腫瘤免疫逃逸和治療的熱點(diǎn)。
如上圖所示，在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1可與免疫細(xì)胞的PD-1受體結(jié)合，促進(jìn)免疫細(xì)胞的失活或凋亡，使腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和增殖。PD-1/PD-L1的相互作用還會(huì)抑制免疫細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)免疫刺激性細(xì)胞因子的分泌，增加免疫抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
在許多癌癥中，腫瘤固有的PD⁃L1 信號(hào)通路通常處于異常激活狀態(tài)。PD⁃L1 異常激活的機(jī)制有很多，例如基因組改變（擴(kuò)增和調(diào)節(jié)）、組成性癌基因信號(hào)激活（MYC、RAS、EGFR）、外源性因素（IFN-γ、TNF-α、EGF、IL-17、IL-27）、表觀遺傳機(jī)制（miRNA、異常的DNA甲基化和組蛋白修飾）。另外，腫瘤微環(huán)境中存在的某些炎癥因子也會(huì)誘導(dǎo) PD-L1 異常表達(dá)，加速 PD-L1 與 PD-1 相互作用，最終使免疫細(xì)胞耗竭無法完成免疫調(diào)節(jié)�？梢奝D-L1的調(diào)控不僅僅某一單一因素，正是這種表達(dá)的多樣性，使得 PD-L1 成為了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。
圖2 PD-L1 的表達(dá)調(diào)控
那么我們介紹了PD-L1，怎么樣才能做出漂亮的WB條帶呢？
01 確定好的研究對(duì)象
有一個(gè)合適的研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)就成功了一半。研究表明， PD-L1 在黑色素瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌和腎細(xì)胞癌等許多腫瘤類型的細(xì)胞中表達(dá)。PD-L1 在癌細(xì)胞中的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞有關(guān)，可通過釋放IFNγ介導(dǎo) PD-L1 表達(dá)。也有研究表明 PD-L1 表達(dá)與病毒感染相關(guān)癌癥有關(guān)。
雖然PD-L1在許多癌細(xì)胞中表達(dá)，但不代表每種腫瘤細(xì)胞都能檢測(cè)到PD-L1的表達(dá)。因此，在選擇某種特定細(xì)胞進(jìn)行探究實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好先查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)看看是否有足夠的表達(dá)量。也可以同時(shí)使用表達(dá)量高的細(xì)胞樣本（如HDLM-2、MDA-MB-231）或者肺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果HDLM-2、MDA-MB-231這些細(xì)胞難以獲得，可以采用IFN-γ誘導(dǎo)的方法，劑量和時(shí)間可以依據(jù)參考文獻(xiàn)。
圖3 THE HUMAN PROTEIN ATLAS中PD-L1在各種細(xì)胞系的表達(dá)量
02 制樣時(shí)要超聲
如果樣本中PD-L1的表達(dá)量不高，裂解細(xì)胞的時(shí)候加以超聲，有助于斷裂染色質(zhì)，同時(shí)增加蛋白的可溶性。對(duì)于主要表達(dá)在膜上的PD-L1，更容易使抗原表位充分暴露出來，與抗體結(jié)合更容易。
超聲的方法也比較簡(jiǎn)單，細(xì)胞或組織裂解后，置于冰上，超聲條件是10-15s，3 次(期間每次間隔10s)，超聲頻率是30%－40%，電流30A; 如果沒有超聲儀，可以采用1ml 帶針頭的注射器冰上反復(fù)抽吸10-15 次替代，直到裂解液澄清好吸為止。
03 裁膜范圍要寬
取什么樣的裁膜范圍合適呢？這要根據(jù)PD-L1的分子量和修飾情況來定。
PD-L1全長(zhǎng)290個(gè)氨基酸，分子量約33kDa，由于剪切可產(chǎn)生2個(gè)異構(gòu)體，所以有時(shí)做Western出兩個(gè)條帶也不要詫異。
PD-L1的活性和穩(wěn)定性受到各種PTM的調(diào)控。糖基化和棕櫚�；瘜�(duì)于維持 PD-L1 的穩(wěn)定性至關(guān)重要。此外，糖基化還會(huì)影響 PD-L1 和 PD-1的結(jié)合。由于PD-L1含有多個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)，在不同樣本中，糖基化修飾的水平不一致，我們實(shí)際觀察到的條帶位置也不在33KDa，通常在40-50kDa，所以各位同學(xué)裁膜時(shí)要包含30-70kDa的區(qū)域，足夠涵蓋絕大部分情況了。
圖4 PD-L1的翻譯后修飾現(xiàn)象
04 mRNA表達(dá)水平僅能作為參考項(xiàng)
PD-L1的mRNA水平與蛋白質(zhì)表達(dá)水平可能不一致。
下圖文獻(xiàn)中雖然正常細(xì)胞檢測(cè)到了mRNA的表達(dá)，可以確定該劑量藥物的誘導(dǎo)下，mRNA水平顯著上升，但是由于WB的靈敏度問題或者蛋白表達(dá)水平低，WB實(shí)驗(yàn)中還是沒有檢測(cè)到正常細(xì)胞的PD-L1，最后是通過過表達(dá)才能檢測(cè)到條帶。
圖5 PD-L1在AGS、SNU-719的表達(dá)水平
部分相關(guān)產(chǎn)品：
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貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
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PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb |
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PD-L1 (Extracellular Domain Specific) (D8T4X) Rabbit mAb |
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PD-L1 (405.9A11) Mouse mAb |
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PD-L1 (D4H1Z) Rabbit mAb |
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Rabbit anti-PD-L1 Monoclonal Antibody |
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Rabbit anti-PD-L1 Monoclonal Antibody |
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InVivoSIM anti-human PD-L1 (Atezolizumab Biosimilar) |
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InVivoMAb anti-human PD-L1 (B7-H1) |
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InVivoMAb anti-mouse PD-L1 (B7-H1) |
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InVivoPlus anti-mouse PD-L1 (B7-H1) |
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InVivoMAb anti-mouse PD-L1 (B7-H1) |
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InVivoMAb anti-mouse PD-1 (CD279) |
參考文獻(xiàn)：
1.Xianjie Jiang, Jie Wang, Xiangying Deng et al. Role of the tumor microenvironment in PDL1/PD-1-mediated tumor immune escape. Molecular Cancer (2019) 18:10.
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4.宋若飄，臧愛民，賈友超. PD⁃L1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展. The Journal of Practical Medicine 2020 Vol.36 No.10.
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