GST標(biāo)簽蛋白純化的選擇與使用小技巧

1、原核表達(dá)用BL21菌株更合適？
BL21 菌株是 Lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型菌株。Lon 是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白酶，ompT 是一種外膜蛋白酶，它們的缺失可以有效減少目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的降解，從而提高 GST 標(biāo)簽蛋白的穩(wěn)定性和產(chǎn)量。

2、蛋白表達(dá)如何優(yōu)化？
培養(yǎng)的溫度，增加通氣性和優(yōu)化誘導(dǎo)條件是最先考慮的改變項(xiàng)。例如，原核表達(dá)體系可以對IPTG誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)時間以及培養(yǎng)溫度進(jìn)行摸索。

3、PreScission，Thrombin和Factor Xa幾種標(biāo)簽切割酶有什么區(qū)別？
（1）這幾種內(nèi)切酶的識別序列不同；
（2）PreScission可在4℃下酶切，且?guī)в蠫ST 標(biāo)簽，可通過GST 柱去除。Thrombin或Factor Xa更適合在室溫條件酶切，酶切后可用苯甲脒的柱子 HiTrap Benzamidine FF 去除多余的酶。
（3）三種酶的酶切緩沖液不同，PreScission：50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5 at 5°C for 16 h。Thrombin：PBS at 22°C  for 16 h。Factor Xa：1 mM CaCl2, 150 mM NaCl, and 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) at 22°C for 16 h
（4）在進(jìn)行GST標(biāo)簽酶切時，應(yīng)注意保證酶的用量和酶切時間，并且酶切應(yīng)在合適的溫度和酶切緩沖液中進(jìn)行。

4、GST標(biāo)簽純化有哪些小TIPS？
我們建議您在結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液中加入1-10mM DTT，以防止GST氧化聚集和還原型谷胱甘肽被氧化。
此外，在純化時也要注意緩沖液的PH，結(jié)合緩沖液最適pH 6.5 – 8，洗脫緩沖液提高pH至8 – 9。
GST 結(jié)合動力學(xué)慢，目標(biāo)蛋白結(jié)合較弱時可適當(dāng)降低上樣流速。

5、Glutathione Sepharose HP，F(xiàn)F，4B有什么區(qū)別，如何選擇？
這3款填料都是Cytiva非常經(jīng)典的GST標(biāo)簽純化產(chǎn)品，三者的配基完全相同，但配基密度和填料骨架略有差異。其中4B這款產(chǎn)品的配基密度較高，載量也較高。具體參數(shù)見下圖

6、GST填料如何進(jìn)行清洗？是否可以耐受氫氧化鈉？
GST填料不耐受氫氧化鈉，0.5 M氫氧化鈉處理填料可導(dǎo)致填料配基完全失活。填料清潔可參考產(chǎn)品說明書。去除蛋白類的殘留，推薦使用6 M鹽酸胍。去除疏水類型的殘留，可使用70%乙醇或者1% Triton X-100。