BTK的信號(hào)通路、已上市靶向藥物及其在腫瘤和自免疾病中的應(yīng)用潛力

布魯頓酪氨酸激酶（Bruton's Tyrosine Kinase，BTK）屬于Tec家族激酶，主要存在于B細(xì)胞和髓樣細(xì)胞中，是B細(xì)胞抗原受體（BCR）信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與B細(xì)胞的發(fā)育、活化、增殖及分化等過(guò)程，其在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

一、BTK相關(guān)通路
BTK在BCR信號(hào)通路中處于核心地位。當(dāng)抗原與BCR結(jié)合后，引發(fā)BCR的寡聚化，激活Lyn、Syk等激酶，進(jìn)而激活BTK。激活后的BTK與BLNK、Lyn、SYK等蛋白形成信號(hào)復(fù)合體，并磷酸化磷脂酶C（PLC）γ2，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放，通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和NF-κB信號(hào)通路的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)基因表達(dá)的改變，從而促進(jìn)B細(xì)胞的存活、增殖和分化。此外，BTK還參與 FcR、細(xì)胞因子、趨化因子等信號(hào)通路，在免疫調(diào)節(jié)中扮演著關(guān)鍵角色。

圖、BTK在BCR信號(hào)通路中的示意圖1

二、靶向BTK已上市藥物
BTK抑制劑是一類針對(duì)布魯頓酪氨酸激酶（BTK）的藥物。自從第一個(gè)BTK抑制劑伊布替尼于2013年上市以來(lái)，BTK抑制劑在血液瘤中得到了廣泛應(yīng)用，目前上市的BTK抑制劑主要分為以下幾類：

（一）不可逆共價(jià)抑制劑
1、伊布替尼（Ibrutinib）：2013年首次獲批，是第一代BTK抑制劑的代表藥物，通過(guò)與BTK活性位點(diǎn)中的半胱氨酸殘基（Cys481）形成共價(jià)鍵，不可逆地抑制BTK的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，在多種B細(xì)胞惡性腫瘤的治療中取得了顯著效果，如慢性淋巴細(xì)胞白血�。–LL）、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤（SLL）、套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）、華氏巨球蛋白血癥（WM）等，還獲批用于治療慢性移植物抗宿主�。╟GVHD）。

2、阿卡替尼（Acalabrutinib）：2017年獲批，是一種第二代不可逆共價(jià)BTK抑制劑，對(duì)BTK的選擇性較高，主要用于治療CLL/SLL和MCL等疾病。

3、澤布替尼（Zanubrutinib）：2019年獲批，也是第二代不可逆共價(jià)BTK抑制劑，具有較高的BTK選擇性，在CLL/SLL、MCL、MZL、WM等多種B細(xì)胞惡性腫瘤中顯示出良好的療效。

4、替拉布替尼（Tirabrutinib）：2020年3月在日本獲批用于治療復(fù)發(fā)/難治性原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤（PCNSL），2021年3月在日本獲批用于治療華氏巨球蛋白血癥（WM），2021年9月在日本獲批用于治療復(fù)發(fā)/難治性淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤（LPL）

5、奧布替尼（Orelabrutinib）：2020年在中國(guó)獲批，用于治療復(fù)發(fā)/難治性套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）、復(fù)發(fā)/難治性慢性淋巴細(xì)胞白血�。–LL）/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤（SLL）。

（二）    可逆非共價(jià)抑制劑
匹托布魯替尼（Pirtobrutinib）：2023年獲批，是目前唯一上市的第三代BTK抑制劑，采用非共價(jià)結(jié)合機(jī)制，可與BTK的非活性構(gòu)象結(jié)合，有望克服因BTK C481S突變而產(chǎn)生的耐藥性問(wèn)題，用于治療既往接受過(guò)至少一種BTK抑制劑治療的復(fù)發(fā)或難治性CLL/SLL、MCL成人患者。

（三）BTK降解劑
BGB-16673：是百濟(jì)神州研發(fā)的PROTAC藥物，通過(guò)招募E3泛素連接酶來(lái)誘導(dǎo)BTK蛋白降解，從源頭上解決耐藥蛋白累積的問(wèn)題，早期臨床數(shù)據(jù)令人矚目，2025年5月已啟動(dòng)頭對(duì)頭挑戰(zhàn)吡托布魯替尼的III期研究。

三、BTK靶點(diǎn)在自免疾病潛力
BTK抑制劑目前在自身免疫性疾病領(lǐng)域全球尚未成藥。奧布替尼在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)末梢周圍對(duì)脫髓鞘疾病的治療中能夠發(fā)揮潛在效果。憑借高靶向選擇性、安全性和血腦屏障（BBB）穿透能力，奧布替尼為治療自身免疫性疾病提供了極具前景的治療方案。

諾誠(chéng)健華，奧布替尼在自免疾病治療中，依據(jù)臨床數(shù)據(jù)顯示呈現(xiàn)出積極效果。

①多發(fā)性硬化（MS），奧布替尼治療MS全球多中心II期臨床數(shù)據(jù)分析顯示，三個(gè)劑量組的 24 周數(shù)據(jù)都達(dá)到主要終點(diǎn)，每天一次80毫克劑量組顯示了最優(yōu)的有效性，并且在整個(gè) 24周內(nèi)病灶控制效果最佳，安全性也最好，這表明每天一次80毫克有潛力成為治療MS的最佳劑量。

②系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE），奧布替尼治療SLE的II期臨床試驗(yàn)取得積極效果，療效呈劑量依賴性的改善趨勢(shì)。奧布替尼治療SLE預(yù)計(jì)2024年完成患者入組。我們期待奧布替尼成為潛在治療SLE的first-in-class BTK抑制劑。

注：以上信息來(lái)自諾誠(chéng)健華官網(wǎng)

四、BTK靶點(diǎn)研究相關(guān)檢測(cè)
（一）THUNDER TR-FRET磷酸化BTK /總BTK檢測(cè)
THUNDER TR-FRET采用經(jīng)典的雙抗夾心檢測(cè)模型檢測(cè)Phospho-BTK和Total BTK水平，兩個(gè)標(biāo)記了熒光Eu和FR的抗體分別識(shí)別BTK不同表位，抗體結(jié)合到BTK后，熒光基團(tuán)相互靠近，320nm激發(fā)后進(jìn)而產(chǎn)生FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移），從而在665nm檢測(cè)熒光信號(hào)值。THUNDER檢測(cè)技術(shù)特異性好，靈敏度高，重復(fù)性好，通量高，操作簡(jiǎn)單，抗體孵育僅需4h，手動(dòng)15min即可完成實(shí)驗(yàn)。

圖、THUNDER BTK磷酸化檢測(cè)原理及流程圖      

 

圖：磷酸化BTK和total BTK在Raji細(xì)胞系中激動(dòng)劑和抑制劑驗(yàn)證數(shù)據(jù)

（二）BTK激酶活性檢測(cè)
ADP激酶活性檢測(cè)，基于生物發(fā)光法的激酶/ATP酶活性檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)檢測(cè)激酶反應(yīng)中生成的ADP量來(lái)反映酶活性。

圖：UA-GLO檢測(cè)原理示意圖

1、UA-GLO激酶活性檢測(cè)試劑盒優(yōu)勢(shì)
① ATP濃度從1μM到1mM 都可以用于實(shí)驗(yàn)，可區(qū)分競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性的激酶抑制劑
② 極高的靈敏度和更大的動(dòng)態(tài)量程：低至0.25pmol的ADP可以被檢測(cè)到
③ 信號(hào)穩(wěn)定：熒光信號(hào)0.5-12hr內(nèi)均可檢測(cè)
④ 便捷的實(shí)驗(yàn)步驟
⑤ 適合于高通量檢測(cè)

2、UA-GLO激酶活性檢測(cè)試劑盒數(shù)據(jù)
檢測(cè)化合物H-89 和PKI的EC50。ATP 競(jìng)爭(zhēng)性化合物H8-9 和ATP 非競(jìng)爭(zhēng)性化合物PKI是激酶PKA的抑制劑。兩個(gè)化合物在三個(gè)ATP濃度:10/100/500μM 的條件下進(jìn)行激酶反應(yīng)之后用UA-Glo 激酶ADP檢測(cè)試劑檢測(cè)產(chǎn)生的ADP�；�合物在不同ATP 濃度下的劑量-效果曲線和EC50結(jié)果見(jiàn)下圖。ATP競(jìng)爭(zhēng)性化合物H8-9的EC50隨反應(yīng)中ATP濃度增加而增大，而ATP非競(jìng)爭(zhēng)性化合物PKI的EC50基本不受ATP濃度的影響。使用市場(chǎng)領(lǐng)先品牌PC對(duì)H8-9在同樣實(shí)驗(yàn)條件，ATP 濃度10μM和100μM時(shí)測(cè)得EC50分別為65nM和567nM, 和UA-Glo激酶ADP檢測(cè)試劑測(cè)得EC值一致。

檢測(cè)化合物星形孢菌素對(duì)三種激酶的EC50。星形孢菌素（Staurosporine, STSP）為多種激酶的抑制劑。用UA-Glo 激酶ADP檢測(cè)試劑檢測(cè)了STSP在不同ATP濃度下對(duì)三種激酶(PKA, CDK2/CycE1, SRPK1)的EC50。STSP在不同ATP濃度下的劑量-效果曲線和EC50結(jié)果見(jiàn)下圖，所得EC50和文獻(xiàn)報(bào)道一致。

（三）    BTK激酶

BTK Protein，GST tag

（四）    BTK PROTAC研究E3連接酶

DDB1/CRBN Complex, His Tag Protein

圖：The CRBN/DDB1 activity was detected using HTRF technology.The reaction was performed by incubating the varying concentration of lenalidomide,CRBN/DDB1protein, substrate and beads at 25℃ for 60 min, then reading ratio 665/620 with BMG.

（五）PROTAC三元復(fù)合物檢測(cè)（PROTAC binding assay）
THUNDER TR-FRET技術(shù)檢測(cè)PROTAC三元復(fù)合物結(jié)合，選擇標(biāo)記熒光供體Eu的 Anti-Tag1的抗體和標(biāo)記熒光受體FR的Anti-Tag2的抗體，抗體分別識(shí)別并結(jié)合E3連接酶和靶蛋白，加入PROTAC后，一對(duì)檢測(cè)抗體相互靠近，激發(fā)Eu產(chǎn)生FRET，能量傳遞給FR，即可檢測(cè)到665nm熒光信號(hào)。信號(hào)強(qiáng)度與PROTAC結(jié)合能力成正比關(guān)系�？贵w孵育僅需1小時(shí)，是檢測(cè)蛋白蛋白相互作用的利器。

圖：THUNDER 檢測(cè)PROTAC三元復(fù)合物結(jié)合示意圖

相關(guān)產(chǎn)品推薦

蛋白
產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
BTK Protein	UA080041	100ug
DDB1/CRBN Complex	UA080011	100ug
TR-FRET檢測(cè)抗體（結(jié)合binding實(shí)驗(yàn)用）
產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
Eu-anti-6xHis	EUHIS-1000	TR-FRET抗體
FR-streptavidin	FRSA-1000	TR-FRET抗體
其他抗體：anti-FLAG，anti-GST，anti-Fc，anti-mFc，anti-RFc標(biāo)簽均可提供
胞內(nèi)蛋白檢測(cè)試劑盒及抗體（信號(hào)通路檢測(cè)）
產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
Total BTK	KIT-BTKT-500	500 pionts
Phospho-BTK（Y233）	KIT-BTKP-500	500 pionts
Phospho-NF-κB（S536）	KIT-NFKBP-500	500 pionts
Total NF-κB	KIT-NFKBT-500	500 pionts
Phospho-ERK (T202/Y204)	KIT-XTM-ERKP-500	500 pionts
Total ERK	KIT-ERKT-500	500 pionts
BTK Recombinant Rabbit mAb(SDT-2105-37)	S0B2376	100ul
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Recombinant Rabbit mAb (S-602-276)	S0B0902	100ul
激酶活性檢測(cè)
產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
UA-Glo Kinase ADP Assay	UA070101	1000 pionts
UA-Glo® Kinase ADP Max Assay Kit	UA079021	1000 pionts