激光共聚焦生物芯片掃描儀解析枯草芽孢桿菌調(diào)控牙周炎炎癥通路的機(jī)制

牙周炎是由多種微生物與宿主免疫反應(yīng)引起的牙周支持組織的慢性炎癥。牙齦上皮細(xì)胞借助模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors, PRRs）識(shí)別包含核心致病菌牙齦卟啉單胞菌等口腔病原體，構(gòu)成了抵御感染的首要屏障。而最為關(guān)鍵的Toll 樣受體（Toll-like receptors, TLRs，TLR4 ）可感知病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs），包括脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）和脂蛋白等。TLR4激活后會(huì)觸發(fā)下游信號(hào)通路（尤其是 NF-κB 通路），促進(jìn)IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這些細(xì)胞因子隨后放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加劇牙周組織損傷。

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，能形成具有高度抵抗力的芽孢，耐受極端高溫、干燥及其他不利環(huán)境條件，可在胃酸、膽汁豐富的胃腸道以及復(fù)雜的口腔微生物生態(tài)系統(tǒng)等惡劣環(huán)境中存活。該菌可通過產(chǎn)生枯草菌素等多種抗菌肽發(fā)揮有益作用，具有抑制牙周致病菌生長(zhǎng)的潛力。

在此前小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌 R0179可通過分泌含有中康酸的上清液，抑制牙齦卟啉單胞菌生長(zhǎng)及生物膜的形成與成熟，進(jìn)而抑制該菌誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎。因此，需要闡明熱滅活枯草芽孢桿菌 R0179 是否通過 TLR 信號(hào)通路調(diào)控牙周炎癥，為牙周炎的預(yù)防和管理提供理論支持。

文章題目為“Inactivated Bacillus subtilis R0179 Inhibits Porphyromonas GingivalisInduced Gingival Inflammation Via TLR2/NF-κB Signaling in a Murine Model of Periodontitis”于2025年8月發(fā)表在Inflammation雜志，作者來自北京大學(xué)口腔預(yù)防學(xué)系國(guó)家口腔臨床研究中心。

研究人員為了評(píng)估牙齦卟啉單胞菌穿透牙齦上皮細(xì)胞的能力，將該菌與牙齦上皮細(xì)胞共培養(yǎng)2小時(shí)后收集樣本，進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察。與對(duì)照組（C組）相比，牙齦卟啉單胞菌感染組（C+Pg 組）中，牙齦卟啉單胞菌可侵入牙齦上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，并被吞噬體包裹形成吞噬小泡（圖1A中箭頭所示）。隨后使用qPCR（定量聚合酶鏈反應(yīng)）和Western blot（蛋白質(zhì)印跡法）檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌刺激后牙齦上皮細(xì)胞中TLR（Toll 樣受體）的水平變化。

結(jié)果表明，與對(duì)照組（MOI=0 的牙齦卟啉單胞菌刺激組）相比，MOI=50 的牙齦卟啉單胞菌可顯著提高細(xì)胞中 TLR4 的蛋白和 mRNA水平。以 MOI=50 的牙齦卟啉單胞菌刺激上皮細(xì)胞12小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌刺激可上調(diào) TLR1、TLR2、TLR4、TLR6 及磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）的表達(dá)，并促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放。為驗(yàn)這些變化，研究人員通過細(xì)胞因子芯片檢測(cè) IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)，使用法國(guó)Innopsys激光共聚焦熒光微陣列生物芯片掃描分析儀進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)及分析。結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌刺激可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)上調(diào)，該結(jié)果也驗(yàn)證了qPCR 實(shí)驗(yàn)中觀察到的細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)趨勢(shì)（如圖1）。

 圖 1 牙齦卟啉單胞菌侵入牙齦上皮細(xì)胞并激活牙齦上皮細(xì)胞中的多種 Toll 樣受體（TLR）及炎癥通路.（A）透射電子顯微鏡圖像顯示，牙齦卟啉單胞菌與牙齦上皮細(xì)胞共培養(yǎng) 2 小時(shí)后被細(xì)胞內(nèi)化的情況。（B）采用 qPCR（定量聚合酶鏈反應(yīng)）和 Western blot（蛋白質(zhì)印跡法），分析不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的牙齦卟啉單胞菌刺激牙齦上皮細(xì)胞 12 小時(shí)后，TLR4 的表達(dá)水平。（C）采用 qPCR 和 Western blot，分析感染復(fù)數(shù)（MOI）為 50 的牙齦卟啉單胞菌在不同時(shí)間點(diǎn)刺激牙齦上皮細(xì)胞后，TLR4 的表達(dá)水平。（D）Western blot 分析上皮細(xì)胞中 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、NF-κB（核因子 κB）及磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）的蛋白表達(dá)水平。各組縮寫如下：對(duì)照組（C 組）、牙齦卟啉單胞菌刺激組（C+Pg 組）。（E）qPCR 分析 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、白細(xì)胞介素 - 1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素 - 6（IL-6）及腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）的信使核糖核酸（mRNA）水平。（F）代表性細(xì)胞因子芯片膜圖像顯示 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的分泌表達(dá)情況。其中，POS-1 和 POS-2 為陽性對(duì)照孔。（G）通過熒光強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞因子芯片結(jié)果進(jìn)行定量分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，* 代表 P<0.05，** 代表 P<0.005，*** 代表 P<0.001。

為探究枯草芽孢桿菌 R0179 是否能逆轉(zhuǎn)牙齦卟啉單胞菌刺激誘導(dǎo)的 TLR、下游 p-NF-κB 及促炎細(xì)胞因子表達(dá)變化，研究人員通過 Western blot、qPCR 和抗體芯片實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。與單獨(dú)牙齦卟啉單胞菌感染組（Pg組）相比，枯草芽孢桿菌 R0179（MOI=50）共刺激組顯著降低了TLR2、TLR4 及 p-NF-κB 的蛋白水平，但對(duì) TLR1 和 TLR6 的蛋白水平無顯著影響。

qPCR 結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌 R0179 處理可下調(diào)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的TLR2、TLR4、IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的 mRNA 水平，對(duì) TLR1 和 TLR6 的 mRNA 水平無顯著影響。此外，枯草芽孢桿菌 R0179 還能下調(diào)牙齦卟啉單胞菌刺激的牙齦上皮細(xì)胞分泌 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的水平。蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了 qPCR 實(shí)驗(yàn)中觀察到的細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)變化趨勢(shì)（圖2）。

 圖 2 枯草芽孢桿菌 R0179 減輕牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的牙齦上皮細(xì)胞中 Toll 樣受體（TLR）/ 磷酸化核因子 κB（p-NF-κB）激活及炎癥反應(yīng).（A）蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）分析 TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、NF-κB 及 p-NF-κB 的蛋白表達(dá)水平。各組縮寫如下：牙齦卟啉單胞菌刺激組（Pg 組）、牙齦卟啉單胞菌 + 枯草芽孢桿菌 R0179 刺激組（Pg+B. subtilis 組）。（B）定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析 TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、白細(xì)胞介素 - 1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素 - 6（IL-6）及腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）的信使核糖核酸（mRNA）表達(dá)水平。（C）代表性細(xì)胞因子芯片圖像顯示 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的分泌情況。（D）通過熒光強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞因子芯片結(jié)果進(jìn)行定量分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，* 代表 P<0.05，** 代表 P<0.005，*** 代表 P<0.001。

為驗(yàn)證枯草芽孢桿菌 R0179 在體內(nèi)調(diào)控牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)炎癥的機(jī)制，研究人員開展了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。對(duì)上頜組織的蘇木精 - 伊紅（H&E）染色結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌刺激會(huì)加重牙齦炎癥，而枯草芽孢桿菌 R0179 處理可減輕該菌誘導(dǎo)的牙齦炎癥程度。與對(duì)照組（C 組）相比，牙齦卟啉單胞菌刺激組（C+Pg 組）中 TLR2、TLR4、p-NF-κB、IL-6、IL-1β 及 TNF-α 的表達(dá)升高；而枯草芽孢桿菌 R0179 處理組（C+Pg+B.subtilis 組）可抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的 TLR2、TLR4、p-NF-κB、IL-6、IL-1β 及 TNF-α 的表達(dá)。此外，TLR2 受體激動(dòng)劑處理可拮抗枯草芽孢桿菌 R0179 的作用，提高 p-NF-κB、IL-6、IL-1β 及 TNF-α 的表達(dá)，而 TLR4 受體激動(dòng)劑處理無顯著影響。

本研究探討了枯草芽孢桿菌 R0179 對(duì)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用，系統(tǒng)評(píng)估了牙齦卟啉單胞菌和枯草芽孢桿菌 R0179 處理后，牙齦上皮細(xì)胞中 Toll 樣受體（TLRs）、磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）及下游促炎細(xì)胞因子表達(dá)的變化。研究結(jié)果不僅證實(shí)了牙齦卟啉單胞菌在牙周炎發(fā)病過程中誘導(dǎo)牙齦炎癥的作用，還揭示了枯草芽孢桿菌 R0179 可能通過抑制 TLR2/NF-κB 通路，減輕牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)揭示，熱滅活枯草芽孢桿菌 R0179 有望成為牙周炎管理中的一種潛在輔助治療手段。

原文鏈接：https://doi.org/10.1007/s10753-025-02348-8

Innopsys 成立于1999年，總部位于法國(guó)圖盧茲，致力于熒光檢測(cè)硬件生產(chǎn)和軟件自主開發(fā)。

IS系列激光共聚焦微陣列生物芯片掃描分析儀： 

* 實(shí)時(shí)激光共聚焦光路和獨(dú)立PMT檢測(cè)器，靈敏度高；
* 多激光光路同時(shí)掃描，掃描速度快；
* 線掃描方式，圖片無拼痕、無需陰影矯正，并有效降低熒光的光漂白現(xiàn)象及信號(hào)損失；
* 掃描和分析基因芯片、核酸芯片、 糖芯片、蛋白芯片、反向蛋白芯片、化合物芯片、單細(xì)胞WB免疫印跡芯片、覆膜芯片、細(xì)胞組織芯片及各種商品化生物芯片；
* 用于蛋白互作分析、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究、疾病標(biāo)志物篩選、化合物藥物篩選、多重因子檢測(cè)，病理組織篩查等研究方向。