基于蠕動(dòng)泵與低剪切的磁懸浮離心泵的TFF和ATF對(duì)細(xì)胞灌流的影響對(duì)比

相比傳統(tǒng)批量和補(bǔ)料分批培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)技術(shù)是增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)工藝效率，提高重組蛋白，特別是單克隆抗體產(chǎn)品，單位體積產(chǎn)量和質(zhì)量的重要手段，經(jīng)過(guò)相當(dāng)一段時(shí)間的發(fā)展，已被生物制藥企業(yè)廣為采用。而細(xì)胞灌流培養(yǎng)是上游生物工藝“唯一”可實(shí)現(xiàn)的連續(xù)技術(shù)，所以隨著連續(xù)工藝的推廣，灌流的使用也是未來(lái)的必然路徑。

作為細(xì)胞灌流培養(yǎng)工藝的核心，細(xì)胞截留設(shè)備的選擇是成功進(jìn)行灌流操作的關(guān)鍵，市面上有基于細(xì)胞沉降、超聲、連續(xù)流離心以及旋轉(zhuǎn)濾器等技術(shù)，雖各具優(yōu)勢(shì)，但也在可放大性、可靠性以及操作風(fēng)險(xiǎn)方面存在一定缺陷，而基于中空纖維切向流過(guò)濾（HF TFF）的細(xì)胞灌流技術(shù)已然成為制藥工業(yè)的市場(chǎng)主流。

蠕動(dòng)泵TFF的問(wèn)題，膜污染和產(chǎn)物截留的原因
用于細(xì)胞灌流培養(yǎng)時(shí)，HF TFF有兩種液流形式：傳統(tǒng)的循環(huán)回路方式和今年來(lái)廣受歡迎的交替流方式，即Alternating Tangential Flow（ATF）。

傳統(tǒng)TFF一般使用蠕動(dòng)泵作為液流驅(qū)動(dòng)方式，液流單向循環(huán)，通常被認(rèn)為在灌流過(guò)程中，容易形成膜污染，導(dǎo)致產(chǎn)物被截留；而ATF采用隔膜泵，液流被往復(fù)“推-拉”，這種技術(shù)假定正/反向的液流形式，可在運(yùn)行過(guò)程中對(duì)膜進(jìn)行反沖，使膜“再生”，從而獲得更好的產(chǎn)物回收。

而Samantha W等研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞灌流培養(yǎng)中，導(dǎo)致傳統(tǒng)蠕動(dòng)泵式TFF膜容易污染，產(chǎn)物截留的主要原因，是蠕動(dòng)泵泵動(dòng)過(guò)程中的“擠壓”方式形成的高剪切所導(dǎo)致的細(xì)胞裂解。

他們的實(shí)驗(yàn)平行比較了蠕動(dòng)泵TFF和ATF，使用孔徑0.2μm的中空纖維組件，進(jìn)行產(chǎn)mAb的CHO細(xì)胞灌流培養(yǎng)，設(shè)置液流流速，使中空纖維內(nèi)的剪切不超過(guò)2000S-1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蠕動(dòng)泵TFF中的細(xì)胞生長(zhǎng)速度低于ATF，活性下降較ATF快，產(chǎn)物截留也較ATF高。

在對(duì)反應(yīng)器中物料顆粒粒徑分布的分析中發(fā)現(xiàn)，采用蠕動(dòng)泵TFF進(jìn)行灌流的反應(yīng)器中，100nm粒徑范圍的顆粒隨著灌流的進(jìn)行，不斷積聚，到第8天，已是ATF的4.5倍。顆粒的這個(gè)大小范圍，與0.2μm的孔徑大小接近，很容易造成堵塞，影響產(chǎn)物透過(guò)。

在對(duì)細(xì)胞活性的分析中也發(fā)現(xiàn)，在蠕動(dòng)泵TFF灌流的反應(yīng)器中，出現(xiàn)了較高水平的細(xì)胞死亡，產(chǎn)生的細(xì)胞碎片以及釋放的核酸、蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞性成分很容易堵塞膜孔，并造成膜污染。

事實(shí)上，膜污染包括幾種不同的形式：膜表面形成凝膠層，膜孔橋接（搭橋）導(dǎo)致實(shí)際孔徑變小以及顆粒“卡”進(jìn)膜孔導(dǎo)致膜孔堵塞等，往復(fù)推拉式的反沖過(guò)程，可以部分去除前兩種污染，但一旦顆粒碎片進(jìn)入膜孔基層，很難去除只能通過(guò)濾出端反沖或更換組件。

磁力離心泵TFF vs.ATF
之后，研究人員將TFF中使用的蠕動(dòng)泵換成了低剪切的磁懸浮離心泵，與ATF進(jìn)行一對(duì)一的重新評(píng)估，培養(yǎng)至目標(biāo)VCD，開(kāi)始cell Bleeding，以維持穩(wěn)定的VCD。結(jié)果顯示，磁力泵TFF和ATF可獲得相同的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，在同一天達(dá)到目標(biāo)VCD，且兩種系統(tǒng)的細(xì)胞死亡率和100nm范圍的顆粒都沒(méi)有差別，且最終的產(chǎn)物收率也接近，磁力泵TFF為73%，ATF為71%。

磁力泵TFF和ATF比較，低剪切的磁力離心泵可消除TFF和ATF的性能差異，獲得相近結(jié)果，包括A）VCD、B）LDH檢測(cè)所得的特異性細(xì)胞死亡率、C）活性、D）產(chǎn)物濾過(guò)以及E）培養(yǎng)液中100nm粒徑范圍的顆�？倲�(shù)。

結(jié)論
所以，文章的結(jié)論可概括為：
1. 傳統(tǒng)TFF系統(tǒng)用于細(xì)胞灌流培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)物濾過(guò)較差，是因?yàn)槠涫褂玫娜鋭?dòng)泵所產(chǎn)生的更高的細(xì)胞死亡率所導(dǎo)致的，而不在于ATF系統(tǒng)中交替式切向流所謂的更高的清洗作用。
2. 如果細(xì)胞死亡率相當(dāng)， TFF系統(tǒng)完全可獲得與ATF系統(tǒng)相似的產(chǎn)物濾過(guò)特性。
3. 使用低剪切的磁懸浮離心泵，將是ATF的可行替代。