共聚焦與熒光成像技術(shù)用于解析高糖下人視網(wǎng)膜類器官的病變
本研究由Lada Poleovska、Simona Trmaová、Canan Celiker、Eva Hrubá、Francisco Molina Gambin、Václav Chochola、Veronika Matusková、Eleni Beli以及Tomás Barta共同完成。研究成果以《Unveiling the cellular and molecular mechanisms of diabetic retinopathy with human retinal organoids》為題在線發(fā)表于《Cell Death and Disease》期刊。
重要發(fā)現(xiàn)
本研究的核心在于利用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）來源的視網(wǎng)膜類器官，構(gòu)建了一個模擬“漸進(jìn)式高血糖應(yīng)激”的人類視網(wǎng)膜研究模型。研究團(tuán)隊沒有采用遠(yuǎn)超生理范圍的極端高糖濃度，而是設(shè)定了一個在類器官培養(yǎng)中常用的高葡萄糖基線（17.5 mM），在此基礎(chǔ)上僅增加7.5 mM的D-葡萄糖，使終濃度達(dá)到25 mM，以此模擬臨床上血糖控制不佳導(dǎo)致的血糖水平進(jìn)一步攀升。通過對比不同分化階段（第30天、第90天、第150天）的類器官在經(jīng)歷28天高糖處理后的變化，研究揭示了視網(wǎng)膜發(fā)育對高血糖響應(yīng)的階段特異性與細(xì)胞類型特異性。
研究首先證實(shí)，在視網(wǎng)膜類器官分化的早期（D30+28）和中期（D90+28）階段，這種程度的血糖升高并未引起顯著的形態(tài)學(xué)改變。無論是類器官整體的神經(jīng)上皮樣結(jié)構(gòu)，還是其內(nèi)部的關(guān)鍵視網(wǎng)膜與神經(jīng)元標(biāo)記物（如RAX、VSX2、PAX6、SOX2、CRX、NRL）的基因表達(dá)與蛋白定位，在高糖組與對照組之間均未發(fā)現(xiàn)明顯差異。同時，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因（BAX, BIM, PUMA）表達(dá)也保持穩(wěn)定。這表明，處于早期發(fā)育和命運(yùn)決定階段的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞和未成熟神經(jīng)元，對高血糖環(huán)境具有相當(dāng)?shù)拇x韌性，其基本發(fā)育程序不受干擾。
02晚期類器官光感受器脆弱
當(dāng)研究聚焦于分化晚期（D150+28）、光感受器趨于成熟的類器官時，景象截然不同。盡管宏觀形態(tài)依然保持，但分子和細(xì)胞層面出現(xiàn)了顯著紊亂�；虮磉_(dá)層面，實(shí)時定量PCR和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）均一致顯示，光感受器外節(jié)的關(guān)鍵功能基因，包括視錐細(xì)胞色素（OPN1SW, OPN1MW, OPN1LW）和視紫紅質(zhì)（RHODOPSIN），以及視錐細(xì)胞抑制蛋白（ARR3）和視桿細(xì)胞抑制蛋白（SAG）等，均出現(xiàn)顯著下調(diào)。結(jié)構(gòu)層面，免疫熒光染色直觀地揭示了高糖處理組類器官中光感受器外節(jié)結(jié)構(gòu)的縮短和相應(yīng)標(biāo)記物信號的減弱。功能層面，使用CellROX™ Green試劑進(jìn)行的氧化應(yīng)激檢測顯示，高糖處理引發(fā)了類器官組織內(nèi)，尤其是外核層和內(nèi)核層區(qū)域，活性氧物種（ROS）的顯著增加。
03氧化應(yīng)激與膠質(zhì)細(xì)胞活化
轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步勾勒出高糖應(yīng)激下的全局分子圖景�；虮倔w（GO）富集分析顯示，受影響的通路高度集中于“G蛋白偶聯(lián)受體信號通路”、“對光刺激的反應(yīng)”和“視覺感知”等與光感受器功能密切相關(guān)的領(lǐng)域。值得注意的是，與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因DUOX1和DUOX2表達(dá)上調(diào)，而超氧化物歧化酶SOD2雖在轉(zhuǎn)錄水平未顯著變化，但其蛋白水平卻明顯升高，提示可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。此外，研究還觀察到了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（CD44, KCNJ10, TGFBR2）上調(diào)，免疫染色也證實(shí)了膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和S100β的表達(dá)增加及其過程的延伸，這是反應(yīng)性膠質(zhì)增生的典型形態(tài)特征，表明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也參與了應(yīng)對高血糖應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)。
04技術(shù)核心：高精度成像與多組學(xué)分析
為了獲得上述發(fā)現(xiàn)，研究綜合運(yùn)用了多項前沿的生物成像與分析技術(shù)。高分辨率三維成像：研究采用激光掃描共聚焦顯微鏡對類器官冷凍切片進(jìn)行成像。通過免疫熒光多重標(biāo)記，研究人員能夠同時在亞細(xì)胞分辨率下觀察不同視網(wǎng)膜細(xì)胞類型（如光感受器、雙極細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）的形態(tài)、分布以及特定蛋白（如光感受器視蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物）的表達(dá)與定位。這種技術(shù)使得可視化高糖導(dǎo)致的“外節(jié)縮短”等細(xì)微結(jié)構(gòu)病變成為可能。活細(xì)胞功能成像：利用CellROX™ Green這種熒光探針，研究人員能夠直接、原位地檢測和量化類器官組織中由高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧，將氧化應(yīng)激這一生化過程轉(zhuǎn)化為可觀察、可定量的熒光信號，并精確定位到特定的視網(wǎng)膜細(xì)胞層。多組學(xué)整合分析：超越單一的形態(tài)或基因觀察，研究通過轉(zhuǎn)錄組測序（NGS）進(jìn)行了全基因組范圍的表達(dá)譜分析。這不僅驗證并擴(kuò)展了靶向PCR的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了更多受影響的基因，還通過生物信息學(xué)分析（如PCA主成分分析、GO富集分析）系統(tǒng)性地揭示了受擾動的主要生物學(xué)通路。此外，研究還將自身數(shù)據(jù)與公開的糖尿病患者視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進(jìn)行比對，找到了在光感受器功能障礙、膠質(zhì)發(fā)生和氧化應(yīng)激反應(yīng)等通路上的一致性，從而在人類組織層面驗證了類器官模型的病理相關(guān)性。
創(chuàng)新與亮點(diǎn)
本研究在方法學(xué)和應(yīng)用價值上均體現(xiàn)了顯著創(chuàng)新，尤其在如何利用先進(jìn)成像與分析技術(shù)解析復(fù)雜生物過程方面。
首先，該研究成功構(gòu)建并驗證了一個更貼近臨床病理生理的“漸進(jìn)式高血糖應(yīng)激”模型。本研究將葡萄糖濃度從17.5 mM適度提升至25 mM，巧妙地模擬了糖尿病患者血糖控制不佳或妊娠期糖尿病等真實(shí)世界中常見的血糖波動場景。這一模型設(shè)計上的突破，使得研究者能夠捕捉到在相對溫和卻持續(xù)的高糖壓力下，晚期光感受器所表現(xiàn)出的選擇性脆弱。
其次，研究深度整合了多維度的成像與組學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了從宏觀結(jié)構(gòu)到微觀分子機(jī)制的貫穿式解析。它并非單一依賴某一種技術(shù)，而是將高分辨率共聚焦三維成像（用于觀察細(xì)胞層結(jié)構(gòu)和蛋白空間分布）、功能熒光成像（用于檢測氧化應(yīng)激等動態(tài)生理過程）與高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析相結(jié)合。
最后，該研究彰顯了人視網(wǎng)膜類器官結(jié)合先進(jìn)成像技術(shù)在光學(xué)生物醫(yī)療領(lǐng)域的巨大應(yīng)用價值。視網(wǎng)膜類器官能夠高度模擬人視網(wǎng)膜的發(fā)育、細(xì)胞類型多樣性和分層結(jié)構(gòu)。當(dāng)與上述成像技術(shù)結(jié)合時，該平臺便成為一個強(qiáng)大的“人類視網(wǎng)膜模擬器”，可用于：1） 疾病機(jī)理的動態(tài)可視化研究：實(shí)時或終點(diǎn)觀測藥物、基因擾動、環(huán)境壓力（如高糖）如何影響特定視網(wǎng)膜細(xì)胞（如脆弱的光感受器）的生存、形態(tài)和功能。2） 高通量藥物篩選與安全性評估：在進(jìn)入臨床前，于高度仿生的人類組織模型上測試神經(jīng)保護(hù)劑、抗氧化劑等潛在療法對減緩光感受器退化、抑制膠質(zhì)增生的效果，并能直觀評估其細(xì)胞毒性。3） 個性化醫(yī)療的探索：利用來自特定患者的iPSC構(gòu)建類器官，結(jié)合成像分析，有望在體外預(yù)測該個體視網(wǎng)膜對高血糖的易感性，或測試其對不同治療方案的響應(yīng)，為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)眼科醫(yī)療提供新工具。
總結(jié)與展望
利用人視網(wǎng)膜類器官模型揭示，漸進(jìn)式的高血糖應(yīng)激會特異性損害晚期分化階段的光感受器，引發(fā)其基因表達(dá)紊亂、結(jié)構(gòu)損傷、氧化應(yīng)激和凋亡增加，同時激活星形膠質(zhì)細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，神經(jīng)退行性改變的重要性，且其具有明顯的細(xì)胞類型和發(fā)育階段特異性。研究所采用的多模態(tài)成像與組學(xué)整合策略，為在人類特異性模型中精細(xì)剖析疾病機(jī)制樹立了典范。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Polešovská L, Trmačová S, Celiker C, Hrubá E, Gambin FM, Chochola V, Matušková V, Beli E, Bárta T. Unveiling the cellular and molecular mechanisms of diabetic retinopathy with human retinal organoids. Cell Death Dis. 2025 Dec 19;16(1):892.
DOI:10.1038/s41419-025-08244-1.
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