QF-Pro蛋白檢測(cè)技術(shù)助力蛋白功能檢測(cè)和分析

鄰近連接反應(yīng)（Proximity Ligation Assay, PLA），作為蛋白相互作用（Protein-Protein Interactions, PPIs）與翻譯后修飾（Post-Translational Modifications, PTMs）檢測(cè)領(lǐng)域的常用技術(shù)，憑借其原理上的可操作性在基礎(chǔ)科研廣泛應(yīng)用。然而，PLA 在分辨率、定量可靠性、數(shù)據(jù)分析效率及臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值等方面存在固有局限，難以滿足更高的需求。

在此背景下，HAWK Biosystems 公司基于FRET-FLIM原理開發(fā)了一種新的蛋白功能檢測(cè)技術(shù)——QF-Pro，并利用PD-1/PD-L1相互作用檢測(cè)，SKBR3 細(xì)胞的Akt/PKB激活等一系列對(duì)比實(shí)驗(yàn)，從分辨率、定量能力、重復(fù)性等方面全面證明QF-Pro技術(shù)是一種比PLA技術(shù)更有效的蛋白質(zhì)功能分析工具。

1. 分辨率

檢測(cè)分辨率，直接決定了對(duì)蛋白相互作用的真實(shí)識(shí)別能力。PLA 技術(shù)的最高分辨率僅40nm，使其難以區(qū)分蛋白是空間鄰近還是真實(shí)相互作用，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。而 QF-Pro 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 10nm 級(jí)超高分辨率，能夠精準(zhǔn)判斷標(biāo)志物間是否存在真實(shí)的功能相互作用。

在藥物阻斷 CHO-K1 細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞的PD-1/PD-L1相互作用檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，QF-Pro 的高分辨率與高靈敏度，成功檢測(cè)到抗 PD-1 阻斷抗體對(duì)PD-1/PD-L1相互作用的阻斷效果；而 PLA 因分辨率不足，未能捕捉到這一關(guān)鍵變化（圖1）。
2. 定量能力

定量的準(zhǔn)確性與可靠性是科研數(shù)據(jù)價(jià)值的核心保障。PLA 本質(zhì)上屬于定性評(píng)估，動(dòng)態(tài)范圍較低，其量化過程依賴操作人員手動(dòng)計(jì)數(shù) “每細(xì)胞信號(hào)點(diǎn)數(shù)”，主觀性強(qiáng)、難以捕捉實(shí)驗(yàn)條件間的細(xì)微差異。

在 SKBR3 細(xì)胞的蛋白激酶 B（Protein Kinase B, Akt/PKB）激活狀態(tài)實(shí)驗(yàn)中，面對(duì)基態(tài)與表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor, EGF）強(qiáng)刺激狀態(tài)的顯著差異，PLA所采用的人工計(jì)數(shù)方式無法識(shí)別兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而 QF-Pro依托FRET原理，以藍(lán)色向綠色 / 黃色的梯度信號(hào)轉(zhuǎn)換，直觀且精準(zhǔn)地量化了不同實(shí)驗(yàn)條件下的蛋白激活狀態(tài)差異，數(shù)據(jù)客觀可追溯，為科研結(jié)論提供了堅(jiān)實(shí)支撐（圖2）。
3. 數(shù)據(jù)分析效率與重復(fù)性

數(shù)據(jù)分析的便捷性與結(jié)果的重復(fù)性直接影響科研效率與數(shù)據(jù)可信度。PLA 的數(shù)據(jù)分析流程繁瑣且耗時(shí)，需操作人員進(jìn)行視覺強(qiáng)度對(duì)比或信號(hào)點(diǎn)計(jì)數(shù)，即便借助 ImageJ 軟件的 “顆粒分析（Analyse Particles）” 功能做后處理，仍因 “信號(hào)點(diǎn)大小不均” 等問題無法區(qū)分實(shí)驗(yàn)條件，導(dǎo)致主觀偏差和低重復(fù)性。而 QF-Pro 的信號(hào)呈現(xiàn)直觀清晰，無需復(fù)雜后處理即可完成量化分析。

以PD-1/PD-L1相互作用水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)為例，真實(shí)患者組織樣本中，QF-Pro無需繁瑣預(yù)處理就能清晰呈現(xiàn) PD-1/PD-L1 功能性結(jié)合狀態(tài)，數(shù)據(jù)分析效率高同時(shí)避免了主觀偏差，而PLA的人工計(jì)數(shù)方式無法有效區(qū)分不同PD-1/PD-L1作用水平（圖3）。
4. 臨床轉(zhuǎn)化能力：經(jīng)實(shí)證驗(yàn)證，具備明確臨床價(jià)值

檢測(cè)技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化潛力至關(guān)重要。在針對(duì) 19 例非小細(xì)胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）患者的臨床驗(yàn)證中，PLA 檢測(cè)的細(xì)胞相互作用數(shù)（平均值、中位數(shù)、最大值）均未展現(xiàn)出任何治療反應(yīng)預(yù)測(cè)趨勢(shì)（p=0.868），無法為臨床治療決策提供有效支持。

而 QF-Pro 量化的 PD-1/PD-L1 相互作用數(shù)據(jù)，不僅顯著預(yù)測(cè)了患者對(duì) PD-1/PD-L1 療法的反應(yīng)（p<0.005），相關(guān)研究結(jié)果還發(fā)表于《臨床腫瘤學(xué)雜志》（Journal of Clinical Oncology）。即便在僅 19 例的小樣本隊(duì)列中，仍保持了穩(wěn)定的預(yù)測(cè)性能，充分證實(shí)了其在臨床療效預(yù)測(cè)中的實(shí)用價(jià)值，為精準(zhǔn)醫(yī)療落地提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐（圖4）。
結(jié)語
PLA 技術(shù)作為傳統(tǒng)的蛋白相互作用檢測(cè)手段，需要在分辨率、定量能力、數(shù)據(jù)分析效率及臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值等多個(gè)方面進(jìn)行升級(jí)，而Hawk公司的QF-Pro 技術(shù)基于FRET/FLIM（熒光共振能量轉(zhuǎn)移 / 熒光壽命成像顯微鏡）原理，以 10 nm 分辨率在原位量化功能蛋白作用，實(shí)現(xiàn)了完美的補(bǔ)充和迭代，提供了更精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案。

廠家介紹
HAWK Biosystems是一家源自西班牙的創(chuàng)新型生物科技企業(yè)，聚焦空間功能蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，其核心技術(shù) QF-Pro® 平臺(tái)基于 FRET/FLIM（熒光共振能量轉(zhuǎn)移 / 熒光壽命成像顯微鏡）原理， 具有超高分辨率、高特異性與靈敏度。

該系統(tǒng)以雙抗體雙位點(diǎn)捕獲目標(biāo)蛋白，以 10 nm 分辨率原位量化功能蛋白的空間圖譜，精準(zhǔn)量化組織中蛋白質(zhì)的相互作用與功能狀態(tài)，突破了傳統(tǒng)技術(shù)僅能檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)的局限。適用于如石蠟包埋的切片、固定的組織切片、固定的孔板內(nèi)細(xì)胞等；廣泛用于蛋白-蛋白相互作用，蛋白翻譯后修飾，免疫治療有效性評(píng)估、腫瘤微環(huán)境信號(hào)解析、藥物靶點(diǎn)原位驗(yàn)證等方向。 
環(huán)亞生物與 HAWK 的合作關(guān)系
環(huán)亞生物科技有限公司（APG BIO）已正式成為 HAWK Biosystems 在中國(guó)地區(qū)的獨(dú)家代理商，全權(quán)負(fù)責(zé) HAWK 核心技術(shù)與產(chǎn)品的全鏈條事務(wù)。作為深耕中國(guó)生命科學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)服務(wù)商，環(huán)亞生物將依托自身成熟的技術(shù)支持體系與市場(chǎng)網(wǎng)絡(luò)，為國(guó)內(nèi)研究者提供 QF-Pro® 空間蛋白質(zhì)定量分析平臺(tái)的推廣、銷售、應(yīng)用培訓(xùn)及售后保障等一站式服務(wù)。