NIR-II納米顆粒高分辨率體內成像：從全身血管可視化到病理微環(huán)境監(jiān)測
本文要點：為實現(xiàn)精準疾病診斷，高發(fā)光效率的熒光探針至關重要。為克服近紅外二區(qū)（NIR-II）有機染料長期存在的量子產(chǎn)率低的局限，本文巧妙地設計了一種聚集誘導發(fā)光（AIE）發(fā)光體TPE-Hexoxyl。通過協(xié)同抑制π-π堆積并最小化分子內電荷轉移，構建出NIR-II納米顆粒，其亮度位居已報道有機探針之列（絕對熒光量子產(chǎn)率ΦPL = 0.9%）。體外研究表明，TPE-Hexoxyl納米顆粒具有優(yōu)異的膠體穩(wěn)定性與顯著的光穩(wěn)定性。活體成像顯示其具備高空間分辨率與長效組織滯留能力，可實現(xiàn)對全身血管系統(tǒng)、腦微血管網(wǎng)絡及淋巴系統(tǒng)的動態(tài)高對比度可視化。尤為突出的是，TPE-Hexoxyl納米顆粒在原位4T1荷瘤小鼠模型中對腫瘤病灶的檢測靈敏度顯著提升，并能精確繪制炎癥性腸病模型中炎癥區(qū)域的空間分布，凸顯其在臨床病理診斷中的變革性潛力。本研究確立了一種用于設計高亮度有機NIR-II熒光團的分子調控范式，為后續(xù)臨床診斷應用提供了先進的分子工具。
方案1. 制備及體內應用NIR-II AIE NPs（TPE-Hexoxyl NPs）用于生物影像
在本研究中，通過引入三苯胺（TPA）和四苯乙烯（TPE）作為分子轉子、3,4-雙（2-乙基己氧基）噻吩作為π橋以及苯并[1,2-c:4,5-c]雙[1,2,5]噻二唑（BBTD）作為電子受體，合理設計了兩種新型D−π−A−π−D型近紅外二區(qū)（NIR-II）聚集誘導發(fā)光（AIE）探針TPA-Hexoxyl和TPE-Hexoxyl。值得注意的是，選擇3,4-雙（2-乙基己氧基）噻吩作為π橋至關重要，因為其兩個2-乙基己氧基鏈顯著增加了分子的空間位阻。這種增加有效地減少了所得熒光團中的π-π堆積，從而提高了聚集態(tài)下的ΦPL。與基于TPA的同類探針相比，TPE部分顯著減弱了扭曲內旋轉（TICT）效應，從而大幅提高了ΦPL。經(jīng)兩親性聚合物包覆后，TPE-Hexoxyl納米顆粒（NPs）-1在極性水溶液中表現(xiàn)出極高的相對ΦPL，高達3.67%（以IR-26為參照，ΦPL=0.05%），絕對ΦPL為0.9%，凸顯了其在生物成像應用中的卓越潛力。TPE-Hexoxyl NPs的卓越亮度使其能夠對深部組織（包括全身血管系統(tǒng)、腦血管系統(tǒng)和淋巴網(wǎng)絡（淋巴結/血管））進行高分辨率成像。此外，該探針在精確映射4T1原位腫瘤和炎癥性腸病模型方面表現(xiàn)出色（方案1），為超靈敏體內疾病診斷建立了一套多功能工具。
圖1. TPA-Hexoxyl和B)TPE-Hexoxyl的分子結構及表征
TPA-Hexoxyl和TPE-Hexoxyl化合物以TPA和TPE作為分子轉子和電子供體合成（圖1A,B）。兩種化合物均具有典型的D−π−A−π−D結構，其中BBTD作為強電子受體。
為闡明其電子性質，進行了密度泛函理論（DFT）計算。優(yōu)化后的基態(tài)（S₀）幾何結構顯示，最高占據(jù)分子軌道（HOMOs）主要定域于噻吩π橋和BBTD核心，而最低未占據(jù)分子軌道（LUMOs）則集中于BBTD核心（圖1C）。盡管TPE單元的電子供體能力弱于TPA，導致TPE-Hexoxyl的HOMO-LUMO能隙（1.61 eV）略大于TPA-Hexoxyl（1.33 eV），但減弱的D−A相互作用有效緩解了TICT效應，從而保證了較高的量子產(chǎn)率。如圖1D所示，TPE-Hexoxyl在S₀與激發(fā)態(tài)（S₁）之間存在顯著結構差異，均方根偏差（RMSD）為11.2 Å，表明光激發(fā)后發(fā)生明顯幾何變化。這種大偏差由激發(fā)誘導的電子重排驅動，導致顯著的結構弛豫，涉及鍵長、鍵角及整體構象的大幅位移。
光物理表征表明，兩種化合物在500–850 nm范圍內具有強吸收，并在900–1200 nm區(qū)域表現(xiàn)出強熒光發(fā)射，凸顯其在NIR-II成像中的潛力（圖1E）。此外，TPE-Hexoxyl在聚集態(tài)下展現(xiàn)出顯著增強的NIR-II熒光，表明非輻射衰減被有效抑制。在THF/水混合溶液中的聚集行為顯示，盡管兩種化合物在THF中熒光微弱，但隨著水含量增加，其發(fā)射顯著增強，表現(xiàn)出典型的聚集誘導發(fā)光（AIE）特征（圖1F）。為評估其TICT效應，研究了兩種分子在不同溶劑中的光譜特性。值得注意的是，TPE-Hexoxyl的發(fā)射強度下降程度低于TPA-Hexoxyl，表明其TICT效應弱于TPA-Hexoxyl。
為提升其在生物成像中的適用性，采用生物相容性兩親性聚合物DSPE-mPEG2K作為載體，通過納米沉淀法制備了水分散性納米顆粒（NPs）。動態(tài)光散射（DLS）與透射電子顯微鏡（TEM）分析表明，TPE-Hexoxyl NPs與TPA-Hexoxyl NPs均呈球形膠束結構，流體動力學直徑分別為72 nm和98 nm（圖1G），在水溶液中Zeta電位分別為−20 mV和−21 mV（圖1H）。如圖1I所示，兩類納米顆粒的熒光強度較其單分子溶液顯著增強，凸顯其聚集誘導發(fā)光（AIE）特性。
隨后，對其熒光發(fā)射特性進行了系統(tǒng)評估。盡管在808 nm激發(fā)下，TPE-Hexoxyl NPs的摩爾消光系數(shù)（ɛ = 4400 M⁻¹ cm⁻¹）低于TPA-Hexoxyl NPs（ɛ = 10700 M⁻¹ cm⁻¹），但以IR-26（在1,2-二氯乙烷中ΦPL = 0.05%）為參照時，TPE-Hexoxyl NPs的相對熒光量子產(chǎn)率（ΦPL = 2.53%）顯著高于TPA-Hexoxyl NPs（ΦPL = 0.69%）（圖1J）。為直觀評估其光學性能，計算了定義為ɛ × ΦPL的熒光亮度。定量分析顯示，在808 nm激光激發(fā)下，TPE-Hexoxyl NPs的亮度值達1.11 m⁻¹ cm⁻¹，較TPA-Hexoxyl NPs（0.74 m⁻¹ cm⁻¹）提升約50%（圖1K），這一提升對高信背比（SBR）成像至關重要。此外，當采用更剛性的聚苯乙烯（PS）-PEG5K作為載體時，TPE-Hexoxyl在水溶液中的ΦPL進一步提升至3.67%（圖1J）。鑒于TPE-Hexoxyl NPs卓越的ΦPL，進一步測定其絕對量子產(chǎn)率，結果達0.9%。此外，TPE-Hexoxyl NPs在PBS緩沖液及10%胎牛血清（FBS）中連續(xù)7天保持穩(wěn)定的粒徑分布。與吲哚菁綠（ICG）相比，該納米顆粒在0.8 W/cm²功率密度的808 nm激光照射20分鐘后表現(xiàn)出極低的光漂白（圖1L），表明其具備優(yōu)異的光穩(wěn)定性和膠體穩(wěn)定性，適用于長期活體成像。
圖2. 體外近紅外二區(qū)熒光成像、組織穿透深度及生物相容性評估
TPE-Hexoxyl NPs在不同濃度下的NIR-II熒光強度（偽青色）通過小動物成像系統(tǒng)捕獲。圖像顯示熒光強度隨濃度增加而增強，可在寬濃度范圍內實現(xiàn)成像應用。在不同長通（LP）濾波器（1000−1250 nm）下亦觀察到明亮發(fā)射，但波長越高，強度越低（圖2A）。為定量評估組織穿透能力，使用808 nm激光激發(fā)體外組織模擬仿體（雞胸組織），并采用優(yōu)化的NIR-II成像參數(shù)（1000 nm LP濾波器、8000 mA電流、200 ms曝光時間）。如圖2B、C所示，TPE-Hexoxyl NPs的熒光強度隨組織厚度呈指數(shù)衰減，在50 mm穿透深度時接近背景水平。這種增強的組織穿透能力源于納米顆粒的高ΦPL與NIR-II光譜窗口固有的生物光子學優(yōu)勢之間的協(xié)同作用，即散射系數(shù)降低和自體熒光抑制。
在開展體內研究前，系統(tǒng)評估了TPE-Hexoxyl NPs的生物安全性，包括其在808 nm激光照射（57.9 mW cm⁻²，5 min）下的光熱性能。光熱實驗表明，即使?jié)舛雀哌_200 µM，TPE-Hexoxyl NPs僅引起溫和的溫度升高（ΔT ≈ 3 °C），表明其光熱加熱效應可忽略不計。在此基礎上，使用人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）、小鼠胚胎成纖維細胞（3T3）和小鼠成纖維細胞（L929）進行的細胞毒性實驗顯示，在濃度高達100 µM時，未觀察到顯著細胞毒性（細胞存活率 > 95%）或對這些正常細胞增殖的抑制作用（p > 0.05）（圖2D）。這些結果證實了TPE-Hexoxyl NPs優(yōu)異的生物相容性。
溶血實驗進一步揭示了其卓越的血液相容性：在100 µM濃度下，溶血率為1.20% ± 0.04%（圖2E），顯著低于ISO 10993–4國際標準規(guī)定的5%安全閾值。通過尾靜脈注射對正常小鼠進行藥代動力學評估顯示，給藥后1小時內血漿濃度迅速下降（圖2F），歸因于納米顆粒快速的全身分布能力，有效減少了局部組織蓄積引起的系統(tǒng)毒性并縮短了代謝周期。這一快速分布特性為高亮度AIEgen的體內生物成像提供了顯著優(yōu)勢�；谀Ｐ陀嬎愕年P鍵藥代動力學參數(shù)如下：消除半衰期（t₁/₂）為45.922 h，平均滯留時間MRT(0-t)為11.511 ± 1.331 h，藥物暴露量AUC(0-t)為6841.188 ± 582.429 mg·L⁻¹·h⁻¹。
圖3. 血管網(wǎng)絡和淋巴結的體內近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像
在TPE-Hexoxyl NPs表現(xiàn)出良好生物相容性及優(yōu)異的體外NIR-II成像潛力的基礎上，本文進一步評估了其在健康小鼠中的血管成像與淋巴結可視化性能。納米顆粒通過尾靜脈注射給藥（200 µL，1 mM濃度）。為更清晰地揭示微血管成像趨勢，開展了平行實驗（N = 7）。成像采用配備1000、1100、1200、1300、1400和1500 nm長通（LP）濾波器的InGaAs相機，記錄腹側與背側方向的血管造影特征（圖3A）。成像結果清晰展現(xiàn)了全身血管網(wǎng)絡，后肢微血管及動靜脈間組織結構在穿透皮膚與組織層后仍可明確分辨，凸顯了高熒光強度對成像質量的關鍵作用。隨著LP濾波器波長增加，血管信號顯著性與成像效能逐步提升。定量統(tǒng)計分析表明，后肢血管（以白色虛線標示）在1400 nm波長下成像性能最優(yōu)，其平均半高寬（FWHM）最小（0.479 ± 0.029 mm），平均信背比（SBR）最高（10.649 ±1.935）（圖3B、C）。該組間極小變異證實了成像結果的高度平行性。耳部毛細血管網(wǎng)絡同樣在1400 nm下獲得最優(yōu)FWHM與SBR指標（圖3D）。頭皮剝離后對腦微血管的進一步觀察顯示，使用1400 nm濾波器可清晰呈現(xiàn)小腦血管結構，包括表淺靜脈、上矢狀竇與橫竇（圖3E）。足墊注射后5分鐘內，納米顆粒在內側腘淋巴結與坐骨淋巴結區(qū)域顯著富集（圖3F）。關鍵的ICG共示蹤實驗表明，納米顆粒與經(jīng)典淋巴示蹤劑在淋巴管、腘淋巴結及坐骨淋巴結中的分布模式近乎一致，證實了其強大的淋巴結靶向能力。綜上，這些結果充分驗證了TPE-Hexoxyl NPs在體內NIR-II熒光成像中的應用潛力。
圖4. TPE-Hexoxyl納米顆粒在原位乳腺癌小鼠模型中的體內近紅外二區(qū)熒光成像
腫瘤成像在癌癥診療一體化中發(fā)揮著關鍵作用，增強滲透與滯留（EPR）效應使納米顆粒能夠實現(xiàn)腫瘤特異性富集，從而支持精準診斷。 在全面評估TPE-Hexoxyl NPs在健康小鼠全身血管網(wǎng)絡與淋巴結的NIR-II熒光成像性能后，本文進一步構建了原位4T1乳腺癌模型，以評價其體內腫瘤靶向能力。如圖4A所示，通過NIR-II熒光成像系統(tǒng)（激發(fā)波長：808 nm，發(fā)射濾光片：1000 nm LP，電流值：3000 mA）進行實時監(jiān)測，揭示了靜脈注射納米顆粒在腫瘤部位的時間依賴性富集特征。定量分析（圖4B）表明，腫瘤熒光強度在48 h達到峰值，隨后逐漸下降；值得注意的是，強熒光信號可持續(xù)至192 h，僅較峰值強度降低37.28%，從而證實TPE-Hexoxyl NPs具有卓越的腫瘤靶向能力與長效滯留特性。為明確生物分布特征，于注射后192 h處死小鼠進行離體分析。切除腫瘤及主要器官的熒光成像（圖4C）結合半定量區(qū)域興趣評估（圖4D）顯示，納米顆粒在腫瘤組織、肝臟和脾臟中呈現(xiàn)顯著富集。該分布模式在機制上與網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)（RES）介導的納米顆粒截留及腫瘤特異性EPR效應的協(xié)同作用一致。至關重要的是，對腫瘤組織及主要器官（心、肝、脾、肺、腎）的H&E染色切片進行組織病理學檢查，未觀察到炎癥浸潤、細胞空泡化或壞死等病理改變，組織結構完整，進一步佐證了該納米平臺良好的生物相容性。
圖5. 炎癥性腸病小鼠模型中TPE-Hexoxyl納米顆粒的體內近紅外二區(qū)熒光成像
TPE-Hexoxyl在乳腺癌NIR-II成像中展現(xiàn)出卓越病灶靶向能力的基礎上，接著利用右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導的炎癥性腸�。↖BD）小鼠模型，探究該納米平臺在體內的炎癥靶向特異性。如圖5A所示，BALB/c小鼠被隨機分為DSS誘導組（N = 4）和對照組（N = 4）。模型組小鼠連續(xù)8天自由飲用含3%（w/v）DSS的飲水，隨后改用普通飲水恢復4天，以模擬疾病進展與緩解過程；對照組小鼠在整個實驗期間均飲用普通飲水。每日監(jiān)測顯示，DSS處理組小鼠自第4天起出現(xiàn)進行性體重下降，至第8天體重降至對照組的81.02%（p < 0.001），并伴有明顯血便（圖5B、C），證實IBD模型成功建立且具備典型臨床表型。所有小鼠于第10天經(jīng)尾靜脈注射200 µL、1 mM的TPE-Hexoxyl NPs。為精確解析信號空間分布，在處死后48 h進行離體NIR-II熒光成像（1000 nm LP濾光片），并使用InGaAs相機系統(tǒng)對兩組小鼠的結腸組織進行系統(tǒng)性成像分析。
離體腸道NIR-II成像顯示，兩組小鼠的小腸段均未檢測到顯著熒光信號（圖5D）。特異性熒光信號主要定位于結腸壁組織，通過Image J軟件進行定量分析證實，DSS處理組結腸的NIR-II信號強度顯著增強（圖5E、F）。值得注意的是，DSS誘導的結腸炎導致結腸顯著縮短（7.0 ± 0.5 cm vs 8.9 ± 0.4 cm，p < 0.05，圖5F），這一宏觀指標反映了炎癥性水腫、免疫細胞浸潤及組織損傷的嚴重程度。從高熒光強度區(qū)域精確采集的結腸組織切片進行組織病理學評估進一步驗證了上述結果：DSS處理組結腸呈現(xiàn)典型炎癥改變，包括密集的炎癥細胞浸潤、隱窩結構紊亂及廣泛的上皮潰瘍，而對照組腸道組織結構保持完整（圖5G）。這些發(fā)現(xiàn)共同確立了一種基于可視化精準評估炎癥性腸�。↖BD）的新型分子成像工具。
綜上所述，本文構建了一種的高亮度NIR-II熒光探針TPE-Hexoxyl，具備聚集誘導發(fā)光（AIE）特性，通過引入3,4-雙(2-乙基己氧基)噻吩作為π橋并優(yōu)化電子供體基團設計而成。通過涵蓋密度泛函理論（DFT）計算與實驗分析的系統(tǒng)研究，揭示了TPE-Hexoxyl納米顆粒中π-π堆積的減弱與扭曲電荷轉移（TICT）效應的抑制協(xié)同作用，使其在水溶液中具有異常高的量子產(chǎn)率（QY），成為目前已報道最明亮的NIR-II有機探針之一。得益于其在NIR-II窗口的高熒光強度，TPE-Hexoxyl納米顆�？蓪崿F(xiàn)小鼠全身血管網(wǎng)絡及淋巴微結構的高分辨率成像，具有高信背比（SBR）與窄半峰寬（FWHM）。此外，借助EPR介導的富集效應，該納米探針可精準勾勒腫瘤與炎癥微環(huán)境，展現(xiàn)出特異性靶向能力。所開發(fā)的納米探針同時具備優(yōu)異的光穩(wěn)定性、生物相容性及長效組織滯留特性，為推進臨床早期診斷技術提供了全新視角。
參考文獻
Lin D, Huang W, Yang H, et al. Ultrabright NIR‐II Nanoparticles for High‐Resolution In Vivo Imaging: From Systemic Vasculature Visualization to Pathological Microenvironment Monitoring[J]. Advanced Materials, 2025: e10493.
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