雙光學(xué)可調(diào)位點(diǎn)的深NIR至NIR-II區(qū)半花青熒光團(tuán)骨架用于體內(nèi)多路成像

本文要點(diǎn)：雙鎖探針因其增強(qiáng)的特異性和多重檢測(cè)能力，在醫(yī)學(xué)診斷和藥物篩選中具有極高應(yīng)用前景。然而，目前用于雙鎖系統(tǒng)的大多數(shù)近紅外（NIR）熒光團(tuán)在NIR窗口的藍(lán)區(qū)（650–800 nm）表現(xiàn)出光譜活性，嚴(yán)重限制了其在深層組織成像中的應(yīng)用。在此，首次報(bào)道了一類新型深NIR至NIR-II半花青熒光團(tuán)（Guilin，GL）骨架，其具備雙光學(xué)校準(zhǔn)位點(diǎn)，適用于雙鎖探針的開發(fā)。這些GL染料通過氯取代的花青/半花青雜化獲得，發(fā)射波長(zhǎng)覆蓋800–950 nm，并含有關(guān)鍵的meso-Cl及羥基/氨基基團(tuán)，可便捷地轉(zhuǎn)化為兩個(gè)不同的反應(yīng)位點(diǎn)，用于多重成像分析。為驗(yàn)證GL染料的適用性，研究者設(shè)計(jì)了一種新型雙鎖探針GL-Cys，其在低半胱氨酸（Cys）濃度下于830 nm處表現(xiàn)出增強(qiáng)發(fā)射，而在高濃度下則出現(xiàn)顯著的765 nm信號(hào)升高。更重要的是，GL-Cys探針可通過體內(nèi)雙通道比率成像，有效區(qū)分胰腺/乳腺癌模型及相應(yīng)腫瘤鐵死亡模型中的Cys水平差異。因此，這一分子設(shè)計(jì)范式建立了一種通用的深NIR至NIR-II半花青骨架，可推廣用于其他分析物的多路成像。

方案1. 創(chuàng)新型深近紅外到近紅外二區(qū)半花菁熒光團(tuán)庫(kù)，具有雙光學(xué)可調(diào)位點(diǎn)，用于雙鎖定探針的開發(fā)

本研究首次引入一系列創(chuàng)新的深NIR至NIR-II半花青熒光團(tuán)（命名為Guilin，GL），其整合了雙光學(xué)校準(zhǔn)位點(diǎn)，為雙鎖探針的開發(fā)建立了一個(gè)通用平臺(tái)（方案1）。所設(shè)計(jì)的GL染料通過經(jīng)典的氯取代花青/半花青雜化方法，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為800–950 nm，并含有關(guān)鍵的meso-Cl及羥基/氨基官能團(tuán)，可實(shí)現(xiàn)多重成像分析�；�于這些熒光團(tuán)骨架，研究者構(gòu)建了一種新型雙鎖探針GL-Cys，其光譜響應(yīng)隨半胱氨酸（Cys）濃度變化而切換：在低Cys濃度下于830 nm處表現(xiàn)出增強(qiáng)發(fā)射，而在高Cys濃度下則出現(xiàn)765 nm信號(hào)的顯著升高。至關(guān)重要的是，GL-Cys探針能夠有效區(qū)分胰腺/乳腺癌小鼠模型及相應(yīng)腫瘤鐵死亡模型中的Cys水平差異，凸顯了GL熒光團(tuán)在多重生物分析應(yīng)用中的潛力。

圖1 . GL的合成路線、熒光光譜和DFT計(jì)算

雜化通常是賦予熒光團(tuán)互補(bǔ)性和多功能性的關(guān)鍵分子工程策略。為了獲得具有雙光學(xué)校準(zhǔn)位點(diǎn)的深NIR至NIR-II熒光團(tuán)，研究者嘗試將氯取代的花青與半花青進(jìn)行雜化，從而產(chǎn)生一類新型的NIR染料（GL-1–8），其含有氯和羥基/氨基光學(xué)校準(zhǔn)基團(tuán)。GL-1–8染料通過經(jīng)典的半花青合成方法以良好產(chǎn)率合成，本研究中使用的GL-1–8合成路線如圖1a所示。所有化合物均通過核磁共振（NMR）光譜（1H和13C）和高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行了驗(yàn)證。

接下來(lái)，本文測(cè)定了GL-1–8在不同溶劑（包括CH₂Cl₂、CH₃OH、MeCN和MeCN/PBS（1:1（v/v）；pH=7.4））中的光物理性質(zhì)。GL-1–8染料在MeOH中的最大吸收峰分別位于766、799、780、824、753、764、853和869 nm。相應(yīng)地，這些染料在深NIR和NIR-II區(qū)域也表現(xiàn)出強(qiáng)熒光，最大發(fā)射峰分別位于825、827、832、839、920、923、927和936 nm，表明其在深層組織成像中的潛力（圖1b和c）。為了提供理解不同供體和受體對(duì)光譜位移影響的理論基礎(chǔ)。密度泛函理論（DFT）計(jì)算顯示，GL-1–8的能隙從2.047 eV逐漸減小到1.759 eV，與實(shí)驗(yàn)光譜數(shù)據(jù)吻合良好（圖1f）。

為了支持GL-1–8染料具有雙光學(xué)校準(zhǔn)位點(diǎn)的設(shè)計(jì)概念，研究者分別驗(yàn)證了meso-Cl和羥基/氨基官能團(tuán)的光學(xué)調(diào)諧能力。首先，將這些染料置于一系列pH水平下，以模擬酚類化合物的質(zhì)子化和去質(zhì)子化。如預(yù)期，GL-1–6（圖1d、e和S4）在不同pH條件下的發(fā)射光譜表現(xiàn)出以λ=820–940 nm為中心的熒光帶增加，以及以λ=740–860 nm為中心的熒光帶減少。此外，吸收光譜也顯示出pH誘導(dǎo)的波長(zhǎng)位移。

方案2 . 用于腫瘤小鼠模型和相應(yīng)腫瘤鐵死亡模型中半胱氨酸（Cys）水平雙通道區(qū)分的雙鎖熒光探針示意圖。

圖2. GL-Cys檢測(cè)不同Cys濃度的研究

為探究GL-Cys區(qū)分檢測(cè)半胱氨酸（Cys）的可行性，評(píng)估了GL-Cys與Cys反應(yīng)過程中吸收光譜的變化（圖2）。當(dāng)加入低濃度Cys（0–60 μM）時(shí)，GL-Cys溶液在610 nm處的吸光度逐漸降低；隨后，在810 nm處出現(xiàn)新的吸收帶，在830 nm處出現(xiàn)新的發(fā)射帶，溶液顏色由藍(lán)色逐漸變?yōu)榫G色（圖2a和c）。值得注意的是，過量Cys的加入導(dǎo)致吸收光譜發(fā)生顯著藍(lán)移，從810 nm移至645 nm，同時(shí)溶液顏色由綠色變?yōu)榍嗑G色。在Cys濃度60–350 μM范圍內(nèi)，765 nm處的熒光強(qiáng)度逐步增強(qiáng)（圖2d）。值得注意的是，GL-Cys的熒光強(qiáng)度與Cys濃度（0–10 μM）之間呈現(xiàn)顯著線性相關(guān)性�；�于熒光光譜，GL-Cys對(duì)Cys的檢測(cè)限（3σ/k）約為31.3 nM（圖2e）。為驗(yàn)證探針在復(fù)雜生物基質(zhì)中的適用性，開展了選擇性實(shí)驗(yàn)以評(píng)估GL-Cys對(duì)多種活性物質(zhì)的響應(yīng)。在通道1（λem = 830 nm）中，僅Cys引起熒光強(qiáng)度7.8倍的增強(qiáng)，而其他物質(zhì)如活性硫/氧/氮物種、氨基酸、陽(yáng)離子和陰離子均未引起顯著熒光增強(qiáng)（圖2f）。同樣，在通道2（λem = 765 nm）中，僅Cys的加入導(dǎo)致熒光強(qiáng)度12.7倍的提升（圖2g）。這些結(jié)果表明，GL-Cys對(duì)Cys的選擇性顯著高于其他測(cè)試的生物物種，適用于生物體系中特異性的雙通道Cys識(shí)別與高保真成像。

圖3. 不同預(yù)處理?xiàng)l件下PANC-1細(xì)胞和4T1細(xì)胞中GL-Cys的共聚焦成像

PANC-1細(xì)胞和4T1細(xì)胞與GL-Cys共孵育，以驗(yàn)證該探針有效區(qū)分不同Cys水平的能力。如圖3a、b、e和f所示，內(nèi)源性Cys觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光發(fā)射。當(dāng)PANC-1和4T1細(xì)胞在與GL-Cys孵育前，先用生物硫醇清除劑N-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM）預(yù)處理30 min時(shí)，紅色熒光顯著減弱，表明細(xì)胞內(nèi)Cys水平降低；相反，若細(xì)胞先用半胱氨酸供體N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）預(yù)處理30 min，再與GL-Cys孵育，則紅色熒光顯著增強(qiáng)，表明NAC補(bǔ)充有效提升了細(xì)胞內(nèi)Cys濃度。綜上，這些結(jié)果表明GL-Cys探針能夠精確檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Cys濃度的升高與降低。

半胱氨酸（Cys）是評(píng)估惡性腫瘤嚴(yán)重程度，尤其是胰腺癌的重要生物標(biāo)志物，腫瘤鐵死亡的發(fā)生也與Cys水平密切相關(guān)。 Erastin是一種細(xì)胞滲透性鐵死亡激活劑，被廣泛認(rèn)為是誘導(dǎo)鐵死亡的有效試劑。因此，進(jìn)一步研究了GL-Cys探針在追蹤鐵死亡過程中Cys水平動(dòng)態(tài)變化中的適用性。PANC-1和4T1細(xì)胞先與erastin預(yù)孵育8 h，再與GL-Cys孵育30 min，結(jié)果觀察到紅色通道熒光強(qiáng)度降低。Fer-1可緩解erastin誘導(dǎo)的胞質(zhì)和脂質(zhì)中活性氧的積累。隨后，PANC-1和4T1細(xì)胞先與erastin孵育8 h，再用Fer-1處理2 h，最后與GL-Cys孵育30 min。與僅用erastin處理的細(xì)胞相比，同時(shí)使用erastin和Fer-1處理的細(xì)胞紅色通道熒光信號(hào)略有增強(qiáng)（圖3c、d、g和h），表明鐵死亡細(xì)胞模型中Cys水平升高。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述發(fā)現(xiàn)（圖3i和j）。這些結(jié)果表明，GL-Cys能夠有效監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞鐵死亡過程中Cys水平的動(dòng)態(tài)變化。

圖4. GL-Cys的體內(nèi)雙通道熒光成像

研究者在正常小鼠和胰腺癌小鼠中系統(tǒng)評(píng)估了GL-Cys的體內(nèi)雙通道熒光成像能力。如圖4所示，GL-Cys通過皮內(nèi)注射給予兩組正常小鼠（第1組：NEM預(yù)處理；第2組：僅注射探針）。圖4e顯示，與第2組相比，第1組注射區(qū)域的熒光信號(hào)顯著降低，通道1僅呈現(xiàn)微弱熒光，通道2無(wú)可檢測(cè)信號(hào)，表明該雙鎖探針GL-Cys能夠通過兩個(gè)通道的熒光信號(hào)有效區(qū)分不同Cys水平。

為評(píng)估GL-Cys在腫瘤小鼠中的成像效能，研究者建立了皮下胰腺腫瘤模型，并在相同時(shí)間窗口內(nèi)觀察皮下注射探針后雙通道熒光的變化（圖4a）。胰腺腫瘤小鼠被分為六組。如圖4e所示，與第2組相比，第3組在通道1的熒光信號(hào)略有增強(qiáng)，而在通道2中，熒光強(qiáng)度從約0.52 ± 0.02升高至1.0 ± 0.02，表明胰腺癌小鼠體內(nèi)的Cys水平顯著高于正常小鼠。對(duì)胰腺腫瘤小鼠施用NEM（第4組）后，雙通道信號(hào)均下降至第2組水平（圖4h和i）。GL-Cys在體內(nèi)可視化胰腺腫瘤模型及腫瘤鐵死亡模型中Cys水平差異的能力進(jìn)一步得到驗(yàn)證。

在腫瘤經(jīng)erastin預(yù)處理48 h后（第5組），皮下注射GL-Cys導(dǎo)致通道1的熒光信號(hào)較第3組略有降低，而通道2的熒光強(qiáng)度則從約1 ± 0.02顯著下降至0.65 ± 0.03（圖4i），表明小鼠胰腺癌鐵死亡過程中Cys水平顯著下調(diào)。此外，當(dāng)腫瘤先經(jīng)erastin預(yù)處理48 h，再經(jīng)Fer-1處理8 h后注射GL-Cys（第6組），通道1和通道2的熒光強(qiáng)度較第5組均略有回升。

圖5. 乳腺癌小鼠模型中探針GL-Cys的體內(nèi)雙通道成像

受GL-Cys在胰腺腫瘤模型中優(yōu)異表現(xiàn)的啟發(fā)，研究者進(jìn)一步將該探針應(yīng)用于乳腺癌腫瘤模型中Cys的雙通道熒光成像。采用BALB/c裸鼠建立皮下乳腺腫瘤模型，并將小鼠分為四組（第1組：腫瘤小鼠 + GL-Cys；第2組：腫瘤小鼠 + NEM + GL-Cys；第3組：腫瘤小鼠 + erastin + GL-Cys；第4組：腫瘤小鼠 + erastin + Fer-1 + GL-Cys）（圖5a）。與第1組相比，第2組的雙通道熒光強(qiáng)度在0至30 min內(nèi)逐漸降低（圖5b），表明NEM誘導(dǎo)使4T1腫瘤內(nèi)Cys水平下調(diào)。在4T1鐵死亡誘導(dǎo)組（第3組）中，與第1組腫瘤小鼠相比，通道1（2.12 ± 0.03降至1.25 ± 0.02）和通道2（4.12 ± 0.03降至2.75 ± 0.02）的熒光強(qiáng)度均顯著下降，表明在4T1小鼠鐵死亡過程中Cys同樣被下調(diào)（圖5c和d）。在第4組中注射鐵死亡抑制劑Fer-1后，通道1和通道2的熒光信號(hào)均較第3組顯著增強(qiáng)（圖5c和d）。NIR比率熒光分析（通道2/通道1）亦驗(yàn)證了上述結(jié)果（圖5e）。為確證鐵死亡的發(fā)生，對(duì)不同處理后的腫瘤組織進(jìn)行了深入分析，并采用商業(yè)試劑盒檢測(cè)腫瘤中Cys、GSH和MDA的水平。結(jié)果顯示，Cys和GSH水平均下降，而MDA水平升高（圖5f–h），從而確證了erastin誘導(dǎo)的4T1腫瘤鐵死亡模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GL-Cys可通過體內(nèi)雙通道熒光成像有效區(qū)分乳腺癌腫瘤模型與相應(yīng)腫瘤鐵死亡模型中的Cys水平差異，凸顯了GL熒光團(tuán)在多重生物分析中的應(yīng)用潛力。

本研究成功構(gòu)建了一類新型深NIR至NIR-II半花青熒光團(tuán)（GL），其具備雙光學(xué)校準(zhǔn)位點(diǎn)，可用于開發(fā)雙鎖探針。這些GL染料通過氯取代的花青/半花青雜化獲得，發(fā)射波長(zhǎng)覆蓋800–950 nm。值得注意的是，這些染料整合了花青與半花青的光學(xué)校準(zhǔn)位點(diǎn)，其光學(xué)性質(zhì)可通過中間位氯（類似花青染料）和末端氨基/羥基（類似半花青染料）輕松調(diào)控，從而顯著推動(dòng)了雙鎖探針的發(fā)展�；�于這些熒光團(tuán)，本文構(gòu)建了一種智能雙鎖探針GL-Cys，其在體外對(duì)Cys表現(xiàn)出優(yōu)異的響應(yīng)性與選擇性，并呈現(xiàn)Cys濃度依賴性的光譜切換行為：在低Cys濃度下增強(qiáng)830 nm發(fā)射，在高濃度下增強(qiáng)765 nm信號(hào)。更重要的是，GL-Cys可通過體內(nèi)雙通道比率熒光成像，有效區(qū)分多種腫瘤模型及其相應(yīng)腫瘤鐵死亡模型中的Cys水平差異，凸顯了GL熒光團(tuán)作為多重生物分析通用平臺(tái)的潛力。因此，GL骨架為開發(fā)靶向多種分析物的先進(jìn)探針提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，可用于深組織中的近紅外多色成像，未來(lái)研究有望將其應(yīng)用拓展至更廣泛的靶標(biāo)范圍。

參考文獻(xiàn)

Liu Q, Li Z, Huang Y, et al. Deep-NIR to NIR-II hemicyanine fluorophore scaffolds with dual optically tunable sites for in vivo multiplexed imaging[J]. Chemical Science, 2025, 16(48): 23394-23404.

⭐️ ⭐️ ⭐️

動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

In Vivo Imaging System

⭐️ ⭐️ ⭐️

 恒光智影

上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評(píng)為“國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)”、“上海市專精特新中小企業(yè)”，獲國(guó)家科技部“重大科學(xué)儀器研發(fā)專項(xiàng)”支持，榮獲上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”科學(xué)儀器項(xiàng)目、上海市2025年度關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)計(jì)劃“計(jì)算生物學(xué)”項(xiàng)目。

恒光智影，致力于為生物醫(yī)學(xué)、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供先進(jìn)的、一體化的成像解決方案。

專注動(dòng)物活體成像技術(shù)，成像范圍覆蓋 400-1700 nm，同時(shí)可整合CT, X-ray，超聲，光聲，光熱成像等技術(shù)。

可為腫瘤藥理、神經(jīng)藥理、心血管藥理、大分子藥代動(dòng)力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學(xué)儀器服務(wù)。