T細(xì)胞攝取in vivo CAR-T載體的方式及機(jī)制

文章來(lái)源公眾號(hào)：胞內(nèi)傳遞            作者：飛師兄

做in vivo CAR-T除了關(guān)注遞送載體，或許我們還應(yīng)該調(diào)研一下用戶(hù)需求——T細(xì)胞如何攝取這些載體？膜融合還是內(nèi)吞？

首先，內(nèi)吞對(duì)于維持T細(xì)胞生理功能具有重要作用

內(nèi)吞作用是 T 細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜內(nèi)陷形成囊泡，實(shí)現(xiàn)胞外物質(zhì)內(nèi)化或膜成分調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制，主要分為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞（CME） 和非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞（CIE） 兩大類(lèi)，二者協(xié)同調(diào)控 T 細(xì)胞受體信號(hào)、抗原識(shí)別、細(xì)胞互作及代謝生長(zhǎng)等核心功能。

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，CME 負(fù)責(zé)精準(zhǔn)、持續(xù)的膜成分調(diào)控（如靜息 TCR 回收、CTLA-4 降解），CIE 負(fù)責(zé)快速、大量的響應(yīng)（如抗原刺激后 TCR 內(nèi)化、巨胞飲代謝供應(yīng)），二者互補(bǔ)維持 T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)與功能。

T 細(xì)胞的內(nèi)吞作用緊密結(jié)合其免疫功能，核心圍繞 TCR 信號(hào)調(diào)控、細(xì)胞互作、抗原處理及代謝生長(zhǎng)展開(kāi)。 

舉兩個(gè)例子：

TCR 相關(guān)的內(nèi)吞過(guò)程 —— 信號(hào)調(diào)控的核心

靜息狀態(tài)：未結(jié)合抗原的 TCR 通過(guò) CME constitutively 內(nèi)吞，隨后回收至細(xì)胞膜，維持膜上 TCR 穩(wěn)態(tài)。

抗原刺激后：
結(jié)合抗原的 TCR（ engaged TCR）同時(shí)通過(guò) CME 和 CIE 內(nèi)化：可溶性抗原刺激傾向 CME，膜結(jié)合抗原刺激傾向 CIE（依賴(lài) TC21、RhoG 等 GTP 酶）。

巨胞飲與代謝支持
靜息 T 細(xì)胞中巨胞飲為組成性活動(dòng)，激活后顯著增強(qiáng)，通過(guò)非特異性?xún)?nèi)化胞外氨基酸，轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體激活 mTORC1 通路，滿(mǎn)足 T 細(xì)胞克隆擴(kuò)增的代謝需求。

T 細(xì)胞通過(guò)巨胞飲作用將細(xì)胞外氨基酸（亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸，即 LQRS）轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，而這種轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于雷帕霉素機(jī)制性靶蛋白復(fù)合物 1（mTORC1）的激活至關(guān)重要，mTORC1 的激活則會(huì)驅(qū)動(dòng) T 細(xì)胞生長(zhǎng)。

以上看出，從生理性角度，T 細(xì)胞主要通過(guò)內(nèi)吞作用攝取外來(lái)物質(zhì)，膜融合并非其生理性攝取外來(lái)物質(zhì)的常規(guī)方式。

那現(xiàn)在的載體如何進(jìn)入T細(xì)胞？
慢病毒載體 —— 膜融合為主，內(nèi)吞為輔：
慢病毒表面糖蛋白（如 VSV-G）先與 T 細(xì)胞膜上受體結(jié)合，多數(shù)情況下直接觸發(fā)病毒包膜與細(xì)胞膜的融合，使病毒核心（含 CAR 基因）進(jìn)入胞質(zhì)，此過(guò)程不依賴(lài)內(nèi)吞；經(jīng)特殊改造的慢病毒（如靶向 T 細(xì)胞表面 CD3 的慢病毒），會(huì)先通過(guò)受體介導(dǎo)被 T 細(xì)胞以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞（CME）攝入形成內(nèi)體，再通過(guò)內(nèi)體膜融合釋放。

LNP 載體 —— 依賴(lài)內(nèi)吞（CIE/CME）：
LNP 通過(guò)表面配體（如靶向 T 細(xì)胞的抗體或肽段）與 T 細(xì)胞膜結(jié)合后，主要被 T 細(xì)胞以非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞（CIE，如巨胞飲）或 CME 攝入，形成內(nèi)體；后續(xù)需通過(guò) “內(nèi)體逃逸” 機(jī)制突破內(nèi)體膜進(jìn)入胞質(zhì)，釋放包裹的 CAR mRNA。當(dāng)然，現(xiàn)在也有著力于開(kāi)發(fā)膜融合的LNP，借助于脂質(zhì)構(gòu)成的改變。

這么看病毒和LNP分別是膜融合和內(nèi)吞的代表，那么哪個(gè)方案更好？

內(nèi)吞內(nèi)吞齊（七）步走：?jiǎn)��?dòng)-組裝-招募-彎曲-斷裂-塑形-釋放：更適配 T 細(xì)胞生理機(jī)制，技術(shù)成熟、安全性高，適合需規(guī)�；�，但是內(nèi)涵體逃逸需要優(yōu)化。

膜融合膜融合的機(jī)制（二）病毒與細(xì)胞的膜融合：理論遞送效率更高（繞開(kāi)內(nèi)體降解），但非 T 細(xì)胞生理方式，如果用病毒存在安全風(fēng)險(xiǎn)，免疫原性等。

從理論上看，結(jié)合 T 細(xì)胞生理性?xún)?nèi)吞的靶向性與膜融合的高效逃逸能力的復(fù)合方案，是兼顧安全、精準(zhǔn)與效率的最優(yōu)選擇。病毒或者LNP可能并不是選擇題in vivo CAR-T：慢病毒還是tLNP？，而是綜合題，或者還有其他更適合的載體，是多選題。

拭目以待吧，這才幾年。