多模態(tài)人類腎臟熒光成像技術(shù)解鎖類器官移植監(jiān)測(cè)評(píng)估新路徑

人類腎臟類器官源自人多能干細(xì)胞（hPS細(xì)胞），在再生醫(yī)學(xué)中展現(xiàn)出巨大潛力，但大規(guī)模生產(chǎn)類器官同時(shí)確保分化保真度的技術(shù)仍面臨挑戰(zhàn)。本文報(bào)道了一種可擴(kuò)展、可重復(fù)且經(jīng)濟(jì)高效的方法，用于從hPS細(xì)胞衍生腎臟類器官（hPSC腎臟類器官），并通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序、共聚焦圖像分析、代謝測(cè)定和CRISPR-Cas9工程等技術(shù)，證明這些類器官在細(xì)胞間接觸后表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄多樣性和細(xì)胞組成。研究團(tuán)隊(duì)將人類腎臟類器官注入離體豬腎臟中，利用常溫機(jī)器灌注（NMP）技術(shù)，展示了hPSC腎臟類器官在體內(nèi)的移植能力，并評(píng)估了免疫反應(yīng)，證實(shí)了該方法的可行性和存活率。通過(guò)原位雜交、免疫組織化學(xué)、共聚焦顯微鏡、圖像分析和定量、體內(nèi)成像以及流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，在NMP和體內(nèi)移植后鑒定出人源細(xì)胞。這項(xiàng)工作為在臨床試驗(yàn)中使用hPSC腎臟類器官進(jìn)行離體細(xì)胞治療奠定了基礎(chǔ)。

重要發(fā)現(xiàn)者包括Elena Garreta、Daniel Moya-Rull、Alberto Centeno、Andrés Marco、Asier Ullate-Agote、Gaia Amato、Carlos J. Aranda、Roger Oria、Daniel Lozano-Ojalvo、Merel B. F. Pool、Tim L. Hamelink、Idoia Lucia Selfa、Federico Gonzalez、Carolina Tarantino、Alejandro Montero Salinas、Patricia Lopez San Martin、Priyanka Koshy、Aleix Gavalda-Navarro、Amaia Vilas-Zornoza、Juan R. Rodriguez-Madoz、Anton Fernández Garcia、Inmaculada Marquez-Leiva、Henri G. D. Leuvenink、Cristobal Belda-Iniesta、Maarten Naesens、Beatriz Dominguez-Gil、Marcelino Gonzalez-Martin、Javier Rodriguez-Rivera、Jordi Ochando、Felipe Prosper、Cyril Moers和Nuria Montserrat。他們發(fā)表的文章題為“Systematic production of human kidney organoids for transplantation in porcine kidneys during ex vivo machine perfusion”，于2025年10月在《Nature Biomedical Engineering》上在線發(fā)表。

重要發(fā)現(xiàn)
01類器官的生成與表征
研究團(tuán)隊(duì)首先開發(fā)了一種可擴(kuò)展的方法，從hPS細(xì)胞生成腎臟類器官。通過(guò)優(yōu)化細(xì)胞間接觸條件，發(fā)現(xiàn)以500個(gè)PIM定向細(xì)胞聚集形成的類器官表現(xiàn)出更高的分化特征，包括更豐富的腎小球樣和腎小管樣結(jié)構(gòu)。單細(xì)胞RNA測(cè)序分析顯示，這些類器官包含腎內(nèi)皮樣、間充質(zhì)樣、增殖樣、足細(xì)胞樣和小管樣細(xì)胞群，且細(xì)胞組成均勻。共聚焦顯微鏡圖像證實(shí)了類器官的分段腎單位結(jié)構(gòu)，例如表達(dá)PODXL和WT1的腎小球樣區(qū)域，以及表達(dá)LTL的近端小管樣區(qū)域。

代謝分析進(jìn)一步表明，500個(gè)細(xì)胞聚集的類器官表現(xiàn)出更高的氧化磷酸化（OXPHOS）生物能量譜，這驅(qū)動(dòng)了近端小管分化。Seahorse分析顯示，與更大規(guī)模聚集的類器官相比，這些小規(guī)模類器官的氧消耗率更高，表明其代謝狀態(tài)更接近成熟腎臟。流式細(xì)胞術(shù)和圖像定量分析驗(yàn)證了近端小管標(biāo)記物L(fēng)TL的陽(yáng)性細(xì)胞比例較高，突出了細(xì)胞間接觸在促進(jìn)分化中的作用。

02移植實(shí)驗(yàn)與成像技術(shù)
在離體實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)使用常溫機(jī)器灌注（NMP）系統(tǒng)將人類腎臟類器官注入豬腎臟。通過(guò)熒光標(biāo)記（如Xenolight近紅外染料）類器官，利用體內(nèi)成像系統(tǒng)（IVIS）進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示，類器官在灌注后均勻分布在腎臟皮質(zhì)區(qū)域，且移植后24小時(shí)和48小時(shí)仍可檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明類器官存活并整合。

共聚焦顯微鏡和原位雜交技術(shù)用于鑒定人源細(xì)胞（如Alu重復(fù)序列），證實(shí)類器官在腎小球和血管結(jié)構(gòu)中存在。免疫組織化學(xué)分析顯示，移植后類器官表達(dá)腎小管標(biāo)記物（如ECAD和LTL），且損傷標(biāo)記物KIM-1表達(dá)較低，說(shuō)明移植過(guò)程未引起嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量了Xenolight陽(yáng)性細(xì)胞的比例，驗(yàn)證了成像數(shù)據(jù)的可靠性。

03免疫反應(yīng)評(píng)估
研究還通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Luminex assay評(píng)估了移植后的免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示，移植組與對(duì)照組在T淋巴細(xì)胞（CD3+、CD4+、CD8+）和單核細(xì)胞比例上無(wú)顯著差異，且細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67表達(dá)未發(fā)生變化。細(xì)胞因子（如IL-6和IL-10）水平也保持穩(wěn)定，表明人類類器官在豬腎臟中未引發(fā)明顯的異種免疫排斥。組織學(xué)分析中，CD68+和CD45+細(xì)胞在腎小球和小管區(qū)分布均勻，進(jìn)一步支持了移植的安全性。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破成像難題
本研究突破了腎臟類器官移植后實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的成像難題。傳統(tǒng)方法難以在活體環(huán)境中跟蹤類器官的存活和整合，而通過(guò)結(jié)合熒光報(bào)告基因（如WT1-GFP）和近紅外成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)類器官的高靈敏度、無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)。例如，CRISPR-Cas9工程生成的WT1-GFP報(bào)告細(xì)胞線允許在類器官分化過(guò)程中實(shí)時(shí)可視化足細(xì)胞樣細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，這為優(yōu)化分化條件提供了直觀工具。

02新成像技術(shù)的應(yīng)用
研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了多模態(tài)成像策略，整合了共聚焦顯微鏡、IVIS光學(xué)成像和流式細(xì)胞術(shù)，從而在微觀和宏觀層面全面評(píng)估類器官移植效果。共聚焦圖像提供了細(xì)胞級(jí)別的結(jié)構(gòu)信息，而IVIS成像實(shí)現(xiàn)了整個(gè)器官的熒光信號(hào)定量，這種組合提高了數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性。此外，原位雜交和免疫熒光技術(shù)的結(jié)合，使得人源細(xì)胞在復(fù)雜組織中的定位更加精確。

總結(jié)與展望
本研究成功開發(fā)了一種可擴(kuò)展的腎臟類器官生產(chǎn)方法，并通過(guò)離體常溫機(jī)器灌注和體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了人類類器官在豬腎臟中的存活和整合能力。成像技術(shù)的創(chuàng)新，如熒光報(bào)告基因和多模態(tài)成像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)類器官動(dòng)態(tài)過(guò)程的高效監(jiān)測(cè)，突破了傳統(tǒng)方法的局限。這些成果為腎臟疾病的細(xì)胞治療提供了新思路，尤其是在器官移植前預(yù)處理方面展現(xiàn)出廣闊前景。未來(lái)，研究可進(jìn)一步探索類器官在更長(zhǎng)移植時(shí)間點(diǎn)的功能恢復(fù)效果，并結(jié)合基因編輯技術(shù)優(yōu)化類器官的免疫兼容性。最終，這項(xiàng)技術(shù)有望推動(dòng)個(gè)性化腎臟再生治療進(jìn)入臨床實(shí)踐，造福終末期腎病患者。

DOI:10.1038/s41551-025-01542-1.