Adawarbler全胚胎旋轉培養(yǎng)技術及其應用研究進展

體外全胚胎培養(yǎng)技術 ( whole  embryo  culture, WEC) 是一種將動物的完整胚胎移植到體外進行培養(yǎng)的實驗技術。也越來越受到科學家的重視和深入研究。 

        Nicholas于1934年采用血漿作為培養(yǎng)基, 證明大鼠胚胎能夠在母體外培養(yǎng)成活 24~36h, 從而創(chuàng)立了該實驗方法。之后, 科學家們對培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法等條件不斷改善。20世紀 80年代, Brown制定了用于評價胚胎的生長和分化情況的評分系統(tǒng), 作為評價胚胎發(fā)育程度的指標。 目前, WEC已經被廣泛用于胚胎發(fā)育、化合物的胚胎毒性和致畸性研究以及藥物的安全評價等 。能夠用于WEC 的胚胎材料來源廣泛, 魚類、兩棲類、鳥類、哺乳類胚胎均可用于實驗。
      采用上述動物胚胎進行的各種研究均已見文獻報道, 例如, 朱小山、端正花等應用斑馬魚胚胎分別研究了富勒烯和雙酚 A 的胚胎毒性;  L i X Y 等應用蛙卵研究了1甲基 3 辛烷基咪唑啉酮溴化物對胚胎發(fā)育的影響; Alva rezl等應用雞胚胎研究了成纖維細胞生長因子 ( FGFs) 的神經誘導作用; Hansen JM 等采用兔胚胎與大鼠胚胎對比研究了谷胱甘肽和半胱氨酸在反應停致畸中的作用等。目前, 利用大鼠或小鼠器官形成期的胚胎通過旋轉培養(yǎng)方法進行化合物的致畸研究最為常見。

1.WEC 技術及其發(fā)展概況

1.1培養(yǎng)方法 

         全胚胎培養(yǎng)技術經歷了從靜態(tài)培養(yǎng)向旋轉培養(yǎng)發(fā)展的過程。20世紀 30 年代, Nicholas等建立了早期的體外靜態(tài)胚胎培養(yǎng)技術。以大鼠肝素化血清與大鼠14~15d的胚胎提取物混合作為培養(yǎng)基, 可使得大鼠胚胎在體外生長。然而, 胚胎生長的時間較短, 一般在培養(yǎng)的 24 h內生長, 而36h后胚胎生長速度即減慢。培養(yǎng)48h內正常生長的胚胎不到一半, 正常分化的胚胎只有3/4。

        New等通過靜態(tài)培養(yǎng)法, 以血漿凝塊作為培養(yǎng)基, 并在培養(yǎng)過程中通入4%-5%CO2氣體, 有效地提高了體節(jié)階段早期胚胎的生長發(fā)育率。通過該實驗還發(fā)現(xiàn), 通入60%的O2氣體對于胎齡較長的胚胎的生長發(fā)育率有提高作用。在此之后, New對其技術進行了改進, 其設計的循環(huán)器裝置采用循環(huán)的同源離心血清培養(yǎng)基進行胚胎培養(yǎng), 在培養(yǎng)過程中通入95% O2和5% CO2氣體。結果證明, 除在30體節(jié)胚胎無法建立血管與尿囊胎盤的連接外, 胚胎生長發(fā)育和器官分化均與體內同齡胚胎無顯著性差異。

        由于循環(huán)器裝置較復雜, New等隨后又設計了一套更為簡便的充氣旋轉瓶裝置, 采用旋轉培養(yǎng)法, 其培養(yǎng)效果與循環(huán)培養(yǎng)器裝置的培養(yǎng)基本一致。目前所采用的WEC技術基本上是在New的實驗基礎上改進而來, 即采用大鼠或小鼠受孕后8-10d的全胚胎,在合適的氣體環(huán)境和適當的培養(yǎng)基條件下, 進行旋轉培養(yǎng)一定時間后, 根據研究目的進行全胚胎評價。

1.2 培養(yǎng)工具

        Adawarbler® WEC001-GT系列是一款基于New等科學家當初的充氣旋轉瓶裝置原理再次創(chuàng)新的革命性的AI智能精密型全胚胎旋轉培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)突破了傳統(tǒng)靜態(tài)或簡單懸浮培養(yǎng)胚胎的局限，集成了 Gastri3 AI三氣智能分配管理系統(tǒng)、高精度壓力控制模塊及EmbyroLive20 遠程攝像模塊。它專為高度模擬體內復雜微環(huán)境而設計，至少支持全胚胎或類器官從E0到E90的長時程動態(tài)培養(yǎng)，廣泛應用于：

• 嚙齒動物全胚胎培養(yǎng) (WEC)
• 類胚胎 (Embryoids) 與類囊胚 (Blastoids) 構建
• 人/鼠類器官 (Organoids) 的長期分化與發(fā)育

• iPSC (誘導多能干細胞) 的動態(tài)擴增

       系統(tǒng)技術原理：該裝置是DAT New和DL Cockroft Experientia 35,138(1979)描述的充氣旋轉瓶裝置(當時領域內首創(chuàng))的現(xiàn)代化改進版本，每個培養(yǎng)瓶都具有封閉獨立的微環(huán)境，并且經過技術工程師二次創(chuàng)新設計成完全適合小鼠等全胚胎等組織培養(yǎng)的可穩(wěn)定長期發(fā)育的精密培養(yǎng)系統(tǒng)。具體的培養(yǎng)方法已經預設在系統(tǒng)內。本裝置中的培養(yǎng)小瓶也同樣基于其經典的"British Turntable Culture (BTC)"標準并進行了現(xiàn)代化制造：

1. 動態(tài)旋轉： 通過DishKP系列可插拔單軸回轉器（20孔位），帶動薄壁（1000μm）培養(yǎng)瓶旋轉，確保持續(xù)的高效率的營養(yǎng)交換和氣體平衡，幾乎無體內流體剪切力，保壓且可自由插拔，更適合高通量培養(yǎng)。
2. 精密控氣： 內置 AI 算法實時調控CO2、O2、N2的體積（%vol）或質量（%wt）比例，支持低氧（Hypoxia）及高氧（Hyperoxia）培養(yǎng)，無需人工干預。
3. 微正壓環(huán)境： 創(chuàng)造高于大氣壓的微正壓環(huán)境（0.0-20.0PSI），并且可以自由控制，非常準確的模擬胚胎或器官發(fā)育過程中的體內生理壓力環(huán)境。

               
                                 圖1：現(xiàn)代化改造高通量的金屬分氣旋轉盤DishKP

1.3培養(yǎng)基和氣體條件

         培養(yǎng)基作為WEC成功與否的關鍵, 長期以來一直是學者們關注的焦點。Nicholas等早期采用雞血漿、淀粉瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、胎盤提取物、瓊脂+不同濃度鹽溶液、雞血漿+大鼠胚胎提取物作為培養(yǎng)基進行胚胎培養(yǎng), 均未取得滿意結果。New等通過實驗證明同種血清是大鼠胚胎體外培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基, 且培養(yǎng)效果與提供血清的大鼠性別、是否懷孕、是否與提供胚胎的大鼠為同一只等因素無關。近年來, 一些國內學者也對WEC的培養(yǎng)基進行了進一步探索。張?zhí)鞂毜韧ㄟ^實驗發(fā)現(xiàn), 用人工合成培養(yǎng)基全部和部分替代大鼠血清進行全胚胎培養(yǎng), 結果發(fā)現(xiàn) TC 199培養(yǎng)基在添加 60%大鼠血清后可替代大鼠血清作為培養(yǎng)基進行全胚胎培養(yǎng)。單用小牛血清及用小牛血清+10% 大鼠血清作為培養(yǎng)基, 胚胎的生長發(fā)育都不能達到純大鼠血清的水平。王秋楓等以90%人血清+10%大鼠血清進行全胚胎培養(yǎng), 除胚胎 DNA 含量外,其他各項生長分化指標與大鼠血清培養(yǎng)的胚胎無明顯差異,可以作為替代培養(yǎng)基用于胚胎早期生長發(fā)育的研究和評價。

         目前用于WEC最常用的培養(yǎng)基為同源即刻離心血清 (immediately centrifugal serum,ICS), 即用于大鼠WEC的培養(yǎng)基為成年健康大鼠麻醉后經腹主動脈快速抽血、立即離心后而分離的血清。

        氣體環(huán)境是決定 W EC培養(yǎng)效果的另一重要因素。New等發(fā)現(xiàn),在氣體系統(tǒng)中加入5% CO2能夠起到中和碳酸氫鹽,維持培養(yǎng)基pH的作用, 有益于胚胎的生長發(fā)育。氧在哺乳動物胚胎器官發(fā)育期的代謝過程中起到重要作用, 合適的氧濃度是WEC成功與否的關鍵。氧濃度過高會導致氧化,氧濃度過低則會造成代謝性應激。New等在確定CO2氣體含量后, 又將O2限定到 20% -95%,觀察胚胎發(fā)育情況,發(fā)現(xiàn)隨著胚胎生長發(fā)育的進行, 耗氧量將會增加。

       目前廣泛應用的WEC氣體系統(tǒng)是由O2,CO2,N2 三種氣體組成。分別于培養(yǎng)開始時、第 16小時,第26小時往培養(yǎng)瓶內通入混合氣體, 其比例變化依次O2:CO2:N2(5:5:90,20:5:75,40:5:55)。

       以上培養(yǎng)條件已實現(xiàn)自動化更改比例，內置在了Gastri3三氣管理系統(tǒng)中，更方便使用人。                                           

                                          圖2：自動化無人干預執(zhí)行的Gastri3 AI三氣管理系統(tǒng)

      關于WEC培養(yǎng)中應注意的問題、WEC技術在生長發(fā)育和毒理學中的應用參考下一章節(jié)。