具有半乳糖靶向的NIR-II納米探針實(shí)現(xiàn)原位肝癌手術(shù)切緣及深度精準(zhǔn)成像

本文要點(diǎn)：準(zhǔn)確識(shí)別肝癌切除手術(shù)中的腫瘤邊界對(duì)于改善患者預(yù)后和減少術(shù)后并發(fā)癥至關(guān)重要。本研究探討了一種新型半乳糖靶向納米熒光探針（Gal–OH-BDP NPs，簡(jiǎn)稱GOB NPs）在動(dòng)物原位肝細(xì)胞癌模型中實(shí)現(xiàn)近紅外二區(qū)熒光成像的可行性。在動(dòng)物原位肝癌模型中進(jìn)行的活體近紅外一區(qū)/二區(qū)成像顯示，瘤內(nèi)注射GOB NPs能實(shí)現(xiàn)其在肝癌組織中的靶向富集。GOB NPs的近紅外二區(qū)成像在腫瘤部位展現(xiàn)最高熒光強(qiáng)度，具有最高的腫瘤/正常肝組織信噪比和最優(yōu)的腫瘤邊界分辨能力。經(jīng)靜脈注射后，GOB NPs顯示出陰性染色特征，從而清晰勾勒出腫瘤邊界，在腫瘤與肝組織間形成鮮明對(duì)比。研究結(jié)果證實(shí)，這種半乳糖靶向的近紅外二區(qū)納米探針不僅能通過(guò)靶向作用精準(zhǔn)區(qū)分腫瘤與正常組織，還能在深層組織中保持顯著的對(duì)比度優(yōu)勢(shì)。這種性能特點(diǎn)使其在臨床肝癌精準(zhǔn)切除術(shù)中具有重要的應(yīng)用潛力�；�于此，GOB NPs為提升肝癌手術(shù)的精確度提供了新的技術(shù)解決方案。

方案1. Gal–OH-BDP NPs結(jié)構(gòu)及NIR-II成像示意圖

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在不使用脂肪乳溶液的情況下，裝有GOB NPs水溶液的毛細(xì)管在近紅外二區(qū)窗口測(cè)得的半高全寬值為522.90±2.64 μm，這清晰地勾勒出毛細(xì)管輪廓。而裝有ICG水溶液的毛細(xì)管在近紅外一區(qū)和近紅外二區(qū)窗口的FWHM值分別為557.60±16.22 μm和525.40±9.17 μm。隨著沉浸深度增加，組織吸收和散射效應(yīng)變得明顯。GOB NPs水溶液毛細(xì)管在近紅外二區(qū)窗口的FWHM值隨2、5、8、11毫米深度依次增至1672.66±34.52 μm、2496.64±25.82 μm、3815.70±169.12 μm和5159.43±59.13 μm（圖1A）。當(dāng)沉浸深度為8毫米時(shí)，毛細(xì)管輪廓仍保持可見(jiàn)。對(duì)于ICG水溶液毛細(xì)管，在近紅外二區(qū)窗口的FWHM值隨2、5、8、11毫米深度分別達(dá)到2277.49±63.38 μm、3443.93±34.99 μm、4919.09±115.64 μm和5218.40±28.74 μm（圖1B）。在近紅外一區(qū)窗口，ICG水溶液毛細(xì)管在2、5、8、11毫米深度的FWHM值依次為4990.79±61.34μm、5228.48±66.10 μm、5275.77±57.70 μm和5252.94±81.65 μm（圖1C）。其近紅外二區(qū)熒光圖像的最大可識(shí)別深度為5毫米。當(dāng)沉浸深度達(dá)到2毫米時(shí)，ICG水溶液毛細(xì)管的近紅外一區(qū)熒光圖像清晰度顯著下降至幾乎無(wú)法分辨的程度。

圖1. 體外毛細(xì)管熒光成像

當(dāng)覆蓋2、5、8及11毫米不同厚度的雞胸組織時(shí)，裝載GOB NPs水溶液的毛細(xì)管在近紅外二區(qū)窗口的半高全寬值分別為939.85±49.31 μm、1923.54±50.14 μm、3771.95±286.18 μm和5996.67±258.70 μm（圖1D）。同樣地，在相同雞胸組織厚度條件下，裝載ICG水溶液的毛細(xì)管在近紅外二區(qū)窗口的FWHM值分別為1471.60±49.27 μm、3112.21±142.69 μm、5776.92±236.61 μm和6119.07±188.00 μm（圖1E）。在近紅外一區(qū)窗口，裝載ICG水溶液的毛細(xì)管在相同組織厚度下的FWHM值則分別為3155.22±127.63μm、4748.15±376.32 μm、5928.54±142.08 μm和6242.55±106.63 μm（圖1F）。與脂肪乳浸沒(méi)成像結(jié)果一致，GOB NPs水溶液在近紅外二區(qū)窗口的最大成像深度為8毫米；而ICG水溶液在近紅外二區(qū)窗口的最大成像深度為5毫米，在近紅外一區(qū)窗口僅為2毫米。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了GOB NPs相較于ICG在組織穿透性方面的顯著優(yōu)勢(shì)。

圖2. 病理毒性研究

在瘤內(nèi)注射GOB NPs后，在白光下觀察到腫瘤內(nèi)快速染料擴(kuò)散（圖2A，B），通過(guò)NIR-II成像獲得的熒光信號(hào)與腫瘤的視覺(jué)輪廓相關(guān)（圖2C）。病理結(jié)果顯示熒光圖像信號(hào)與腫瘤的實(shí)際邊界一致（圖2D，E），從而證實(shí)了肝癌組織中GOB NPs的靶向聚集。

圖3. 腫瘤與正常肝組織比值比較及亞組分析

靜脈注射ICG 72小時(shí)后采集近紅外一區(qū)/二區(qū)圖像（圖3A-C），瘤內(nèi)注射GOB NPs后采集近紅外二區(qū)圖像（圖3D-E）。對(duì)腫瘤近紅外熒光圖像進(jìn)行定量分析，采用腫瘤/正常肝組織信噪比（TNR）指數(shù)量化腫瘤與正常肝組織的視覺(jué)對(duì)比度。在無(wú)雞胸組織覆蓋條件下，三組間TNR存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（F=48.945, p<0.001）：近紅外二區(qū)GOB組（TNR=5.12±1.06, n=10）的TNR值顯著高于近紅外二區(qū)ICG組（TNR=3.03±0.68, n=10；均值差=2.10, 95% CI [1.25, 2.94], p<0.001）和近紅外一區(qū)ICG組（TNR=1.80±0.38, n=10；均值差=3.32, 95% CI [2.47, 4.16], p<0.001）；同時(shí)近紅外二區(qū)ICG組較近紅外一區(qū)ICG組仍具顯著優(yōu)勢(shì)（均值差=1.22, 95% CI [0.38, 2.06], p<0.01）（圖3F）。

對(duì)TNR三組分的亞組分析（腫瘤部位熒光、正常肝組織背景熒光及環(huán)境背景熒光）顯示：近紅外二區(qū)GOB組的腫瘤區(qū)域熒光強(qiáng)度（224.31±6.41）顯著高于近紅外二區(qū)ICG組（203.71±14.88）和近紅外一區(qū)ICG組（146.56±33.48）（F=35.188, p<0.001）；在正常肝組織背景熒光方面，近紅外一區(qū)ICG組背景熒光最高（88.83±24.76），近紅外二區(qū)GOB組（45.94±7.68）顯著低于近紅外二區(qū)ICG組（70.01±12.13）（均值差=-24.07, 95% CI [-42.40, -5.75], p<0.01），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.923, p<0.001）；環(huán)境背景熒光分析表明，在相同成像設(shè)備和激發(fā)條件下，近紅外二區(qū)GOB組（0.88±0.44）與近紅外二區(qū)ICG組（0.54±0.26）無(wú)顯著差異（均值差=0.34, 95% CI [-0.01, 0.68], t=2.055, p>0.05），而近紅外一區(qū)ICG組因設(shè)備無(wú)濾光片且成像波長(zhǎng)較短，環(huán)境背景熒光更高（11.11±5.07），與近紅外二區(qū)GOB組（均值差=10.23, 95% CI [6.85,13.61], t=6.358, p<0.001）和近紅外二區(qū)ICG組（均值差=10.57, 95% CI [7.19,13.94], t=6.583, p<0.001）均存在顯著差異（圖3G）。

圖4. 熒光圖像中腫瘤邊緣分辨率的比較

通過(guò)計(jì)算腫瘤邊緣像素的灰度值變化率量化腫瘤邊緣分辨率。分析顯示：近紅外二區(qū)GOB組的灰度值變化率最高（160.11±23.31, n=10），顯著優(yōu)于近紅外二區(qū)ICG組（101.17±18.29, n=10；均值差=58.94, 95%置信區(qū)間[39.33,78.54], p<0.001）和近紅外一區(qū)ICG組（36.83±7.76；均值差=123.27, 95%置信區(qū)間[103.67,142.89], p<0.001），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=121.572, p<0.001）。在使用相同成像設(shè)備與激發(fā)條件的兩組間對(duì)比中，近紅外二區(qū)GOB組較近紅外二區(qū)ICG組在腫瘤部位呈現(xiàn)更高熒光強(qiáng)度（253.48±12.93 vs 218.10±22.14；均值差=35.39, 95%置信區(qū)間[18.36,52.42], t=4.365, p<0.001），且鄰近肝組織背景熒光更低（93.37±15.62 vs 116.92±12.57；均值差=-23.55, 95%置信區(qū)間[-36.86,-10.23], t=-3.715, p<0.01）（圖4C）。

在雞胸組織不同厚度覆蓋條件下進(jìn)行瘤內(nèi)注射GOB NPs后獲取近紅外二區(qū)圖像，靜脈注射ICG 72小時(shí)后獲取近紅外一區(qū)/二區(qū)圖像（圖4A-B）。當(dāng)覆蓋2毫米雞胸組織時(shí)，近紅外一區(qū)ICG組的腫瘤區(qū)域熒光信號(hào)顯著衰減（TNR降至1.48±0.29, n=10），導(dǎo)致腫瘤邊緣在熒光圖像中幾乎無(wú)法辨識(shí)；而近紅外二區(qū)GOB組的TNR（3.62±0.98, n=10）顯著高于近紅外二區(qū)ICG組（2.20±0.57, n=10；均值差=1.42, 95% CI [0.67,2.16], p<0.001）和近紅外一區(qū)ICG組（均值差=2.13, 95% CI [1.39,2.88], p<0.001），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.014, p<0.001）。

當(dāng)組織厚度增至5毫米時(shí)，近紅外一區(qū)ICG組腫瘤輪廓完全消失（TNR=1.10±0.06），近紅外二區(qū)GOB組的TNR（2.76±0.86）仍顯著優(yōu)于近紅外二區(qū)ICG組（1.56±0.22；均值差=1.20, 95% CI [0.63,1.77], p<0.001）（F=27.804, p<0.001）。組織厚度達(dá)8毫米時(shí)，近紅外二區(qū)ICG組TNR降至1.22±0.19，與近紅外一區(qū)ICG組（1.09±0.12）均無(wú)法檢測(cè)腫瘤信號(hào)（組間無(wú)顯著差異：均值差=0.14, 95% CI [-0.31,0.58], p>0.05）；而近紅外二區(qū)GOB組仍維持1.97±0.65的TNR（保留微弱腫瘤熒光可視性），與近紅外二區(qū)ICG組（均值差=0.74, 95% CI [0.30,1.19], p<0.01）及近紅外一區(qū)ICG組（均值差=0.88, 95% CI [0.44,1.32], p<0.001）差異顯著。當(dāng)組織厚度增至11毫米時(shí)，三組均無(wú)法檢測(cè)腫瘤信號(hào)，組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.592, p>0.05）（圖4D）。

圖5. 靜脈注射GOB-NPs對(duì)原位肝細(xì)胞癌的陰性染色

后續(xù)觀察到靜脈注射GOB NPs后其在正常肝實(shí)質(zhì)與肝臟腫瘤的攝取情況（圖5A）。注射后24小時(shí)成像顯示肝腫瘤區(qū)域呈現(xiàn)"陰性染色"特征：腫瘤部位無(wú)熒光信號(hào)，而正常肝實(shí)質(zhì)呈現(xiàn)強(qiáng)熒光，形成鮮明視覺(jué)對(duì)比（圖5B）。這種對(duì)比模式在伴有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶的大型肝癌（圖5C）及小型肝癌（圖5D）中均表現(xiàn)顯著。定量分析表明肝/腫瘤對(duì)比度達(dá)2.33±0.56（n=3）；近紅外二區(qū)熒光信號(hào)邊界處高熒光與低熒光區(qū)域的病理結(jié)果證實(shí)，靜脈注射GOB NPs產(chǎn)生的陰性染色成像可有效區(qū)分腫瘤與正常肝實(shí)質(zhì)，從而精確定位腫瘤邊界。

本研究通過(guò)聯(lián)合新型GOB NPs熒光探針與瘤內(nèi)注射策略，顯著提升原位肝癌成像質(zhì)量，使近紅外二區(qū)GOB組獲得最高腫瘤/正常肝組織信噪比（TNR=5.12），較近紅外二區(qū)ICG組（TNR=3.03）和近紅外一區(qū)ICG組（TNR=1.80）實(shí)現(xiàn)對(duì)比度突破性優(yōu)化。該策略通過(guò)增強(qiáng)腫瘤區(qū)熒光強(qiáng)度（224.31±6.41 vs 203.71±14.88）與抑制肝背景熒光（45.94±7.68 vs 70.01±12.13），結(jié)合腫瘤邊緣灰度變化率提升至160.11±23.31（較ICG組提高58%），實(shí)現(xiàn)術(shù)中腫瘤邊界毫米級(jí)精準(zhǔn)勾勒。GOB NPs在近紅外二區(qū)發(fā)射峰賦予8毫米深部組織探測(cè)能力，其靜脈注射后基于庫(kù)普弗細(xì)胞分布差異產(chǎn)生獨(dú)特"陰性染色"特征（肝/腫瘤對(duì)比度2.33±0.56），而瘤內(nèi)注射激活受體靶向正對(duì)比成像，雙模式協(xié)同為肝癌手術(shù)提供全病灶可視化解決方案，既能精確定位原發(fā)灶又能篩查轉(zhuǎn)移灶，顯著提升腫瘤全切率并降低術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。未來(lái)研究需聚焦GOB NPs的臨床轉(zhuǎn)化，包括優(yōu)化生產(chǎn)工藝、建立嚴(yán)格質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及制定標(biāo)準(zhǔn)化生物安全評(píng)價(jià)體系，旨在為肝癌精準(zhǔn)外科手術(shù)提供可靠創(chuàng)新的成像工具。

 

參考文獻(xiàn)

Liu Z, Zeng T, Dang H, et al. Precision Visualization of Surgical Margins and Depth Imaging Performance in Orthotopic Hepatocellular Carcinoma Using Galactose-Targeted NIR-II Fluorescence Nanoprobe[J]. Analytical Chemistry, 2025，97, 30, 16619–16627.

 

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