分子克隆的常用方式及特點(diǎn)

分子克�。∕olecular Cloning）是指將目的DNA片段（如一個(gè)基因）從復(fù)雜的基因組中“復(fù)制”出來(lái)，并將其插入到一種能夠自主復(fù)制的載體（如質(zhì)粒）中，再將這個(gè)重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞（如大腸桿菌）進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的過(guò)程。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，它就是一個(gè)“復(fù)制+粘貼”的過(guò)程，只不過(guò)操作對(duì)象是DNA分子。

分子克隆的常用方式

1.1 酶切連接
酶切連接法屬于經(jīng)典的分子克隆方法，利用限制性內(nèi)切酶切割目的基因DNA和載體DNA，再利用DNA連接酶連接DNA，最后轉(zhuǎn)化篩選及純化，完成重組基因的大量制備。

圖1 酶切連接流程

成功的酶切和有效的連接是分子克隆實(shí)驗(yàn)圓滿完成的必要條件。分子克隆技術(shù)中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性DNA。粘性末端，即限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈上交錯(cuò)切割，形成的核苷酸順序互補(bǔ)的，可形成氫鍵的末端（見(jiàn)圖2）；平末端，限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNA分子，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片段（見(jiàn)圖3）。

圖2 EcoRI切割DNA形成粘性末端DNA片段

圖3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

愛(ài)必信擁有目前常用的如快速內(nèi)切酶BsaI（abs60206）、快速內(nèi)切酶AgeI（abs60338）、快速內(nèi)切酶EcoRI（abs60213）、快速內(nèi)切酶HindIII（abs60217）等在內(nèi)的70款限制性內(nèi)切酶（詳情點(diǎn)擊：https://www.absin.cn/restriction-enzyme.html）

✅快速：5-15min內(nèi)即可完成酶切；
✅便捷：共用一種酶切Buffer，簡(jiǎn)化酶切體系；
✅兼容性高：在不同緩沖液中均具有極高活性；
✅種類齊全：輕松應(yīng)對(duì)各類酶切實(shí)驗(yàn)。

核酸片段可以通過(guò)連接酶的作用連接起來(lái)而獲得重組分子。常用的DNA連接酶是T4 DNA連接酶——T4 DNA Ligase（abs60084），被稱為生物界的“502”。在有Mg²⁺和ATP存在的條件下，T4 DNA Ligase能催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5´-磷酸末端和3´-羥基末端形成磷酸二酯鍵。

1.2 TOPO克隆
TOPO克隆實(shí)際是基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的克隆技術(shù)，關(guān)鍵是拓?fù)洚悩?gòu)酶。該技術(shù)不需要限制性內(nèi)切酶或外源連接酶，從而提供了將新的PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中的極其簡(jiǎn)便快捷的方法，實(shí)現(xiàn)“切-粘”一步完成。

TOPO克隆特點(diǎn)：
1）適用于連接平末端和帶3’-A的PCR產(chǎn)物。
2）連接反應(yīng)僅需5min。
3）陽(yáng)性率高：無(wú)自連、零背景，無(wú)需藍(lán)白斑篩選，陽(yáng)性克隆比例高，極少出現(xiàn)空載體。

表1愛(ài)必信TOPO克隆產(chǎn)品

愛(ài)必信快速多片段無(wú)縫克隆預(yù)混液（abs60619，為abs60250的升級(jí)版）特點(diǎn)：
✅極速高效：最快5min即可完成克隆，陽(yáng)性率超過(guò)95%；
✅操作簡(jiǎn)單：無(wú)需酶切連接，一步反應(yīng)即可完成單/多片段組裝；
✅高保真度：HiFi高保真連接酶，顯著提高成功率；
✅優(yōu)化升級(jí)：優(yōu)化配方，穩(wěn)定性更強(qiáng)，可耐受熱、氧等環(huán)境。

圖4 愛(ài)必信快速多片段無(wú)縫克隆預(yù)混液（abs60619）操作流程

愛(ài)必信分子克隆系列部分產(chǎn)品清單