新型寬場熒光成像技術(shù)實現(xiàn)毫米級景深捕捉小鼠腦區(qū)細(xì)胞動態(tài)

本論文由Hao Xie、Xiaofei Han、Guihua Xiao、Hanyun Xu、Yuanlong Zhang、Guoxun Zhang、Qingwei Li、Jing He、Dan Zhu、Xinguang Yu和Qionghai Dai共同完成，論文標(biāo)題為"Multifocal fluorescence video-rate imaging of centimetre-wide arbitrarily shaped brain surfaces at micrometric resolution"發(fā)表于《Nature Biomedical Engineering》。

重要發(fā)現(xiàn)
01技術(shù)原理與系統(tǒng)設(shè)計
MFIAS技術(shù)的核心在于結(jié)合計算機視覺和光學(xué)設(shè)計，通過主動成像框架實現(xiàn)非平面表面的高分辨率動態(tài)成像。系統(tǒng)首先自動檢測表面輪廓，然后基于輪廓信息設(shè)計時空編碼照明序列，利用旋轉(zhuǎn)盤在單幀曝光時間內(nèi)完成快速軸向掃描。旋轉(zhuǎn)盤由不同厚度的玻璃組成，通過連續(xù)旋轉(zhuǎn)改變焦點位置，類似于物理學(xué)中的“斷鉛筆錯覺”效應(yīng)，從而在毫米級景深內(nèi)實現(xiàn)近連續(xù)調(diào)焦。同時，數(shù)字微鏡器件（DMD）用于時空調(diào)制樣本照明，確保僅對焦區(qū)域被選擇性照亮，從而提升光子效率和減少光毒性。

系統(tǒng)工作時，旋轉(zhuǎn)盤的位置通過紅外探測器監(jiān)控，并與DMD和相機同步，確保曝光期間每個玻璃厚度對應(yīng)一個照明模式，最終圖像整合了不同深度的焦區(qū)信息。這種設(shè)計使得MFIAS能夠在保持高分辨率的同時，覆蓋厘米級視場，且成像速度僅受相機幀率限制，最高可達(dá)每秒50幀。

02實驗驗證與性能表征
為驗證MFIAS性能，研究團(tuán)隊在RUSH宏觀系統(tǒng)上進(jìn)行了測試，使用0.5微米熒光微球作為樣本。實驗表明，焦點移位與玻璃厚度呈線性關(guān)系，且橫向點擴散函數(shù)（PSF）在全視場內(nèi)保持均勻，平均半高全寬（FWHM）介于1.4至1.6微米之間，不隨玻璃厚度增加而惡化。與傳統(tǒng)顯微鏡相比，高數(shù)值孔徑（NA=0.3）系統(tǒng)雖分辨率高但景深�。�約10微米），低數(shù)值孔徑（NA=0.1）系統(tǒng)景深大（約90微米）但分辨率低三倍；MFIAS則通過掃描整個軸向范圍并僅檢測焦內(nèi)信號，實現(xiàn)了高分辨率、大景深和高光子效率的平衡。

此外，MFIAS可靈活集成到多種宏觀系統(tǒng)中，如定制單反鏡頭系統(tǒng)（MFIAS-SLR），在7毫米視場內(nèi)實現(xiàn)7.4微米分辨率成像。通過對小鼠大腦進(jìn)行熒光標(biāo)記實驗，MFIAS提供了全腦表層高分辨率圖像，而傳統(tǒng)顯微鏡僅能聚焦中央?yún)^(qū)域，證明了其在復(fù)雜曲面成像中的優(yōu)勢。

03生物應(yīng)用示例
在神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用中，MFIAS被用于記錄轉(zhuǎn)基因小鼠（Rasgrf2-2A-dCre;Ai148D）大腦淺層皮質(zhì)自發(fā)活動。該系統(tǒng)以10幀/秒速度捕獲整個皮質(zhì)神經(jīng)響應(yīng)，通過CNMF-E算法和OASIS方法提取鈣信號，結(jié)果顯示神經(jīng)元信號在全視場內(nèi)分布均勻，峰值信噪比（PSNR）恒定，而傳統(tǒng)顯微鏡在邊緣區(qū)域PSNR降至基線水平。MFIAS還成功檢測到視覺刺激下視覺皮層中的方向選擇性神經(jīng)元，為神經(jīng)編碼研究提供了新視角。

在免疫學(xué)方面，MFIAS實時追蹤了顱骨開窗后小鼠腦表面中性粒細(xì)胞的遷移行為。實驗觀察到中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)流動、黏附及組織內(nèi)遷移的多步過程，并利用TrackMate軟件分析細(xì)胞運動模式，揭示了集體遷移和聚集現(xiàn)象。這種大視場成像能力為炎癥反應(yīng)機制研究提供了前所未有的細(xì)節(jié)。

創(chuàng)新與亮點
01突破傳統(tǒng)成像局限
MFIAS技術(shù)核心創(chuàng)新在于解決了寬場熒光顯微鏡在曲面成像中的根本難題：傳統(tǒng)技術(shù)無法同時兼顧高分辨率、大視場、高速和深景深。例如，快速軸向掃描方法（如壓電平臺）受限于重量和速度；遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)增加系統(tǒng)復(fù)雜度；可調(diào)透鏡存在視場和速度權(quán)衡；而光場顯微鏡等計算方需要先驗信息且易產(chǎn)生偽影。MFIAS通過旋轉(zhuǎn)盤和選擇性照明的簡單設(shè)計，實現(xiàn)了物理光學(xué)與計算視覺的融合，無需復(fù)雜重建即可獲得無偽影圖像。

技術(shù)亮點包括：首先，旋轉(zhuǎn)盤機制使系統(tǒng)每秒掃描達(dá)16.8億體素，吞吐量比單平面采集提升100倍；其次，平面光學(xué)元件在遠(yuǎn)心系統(tǒng)中平等處理全視場，確保高分辨率一致性；最后，主動照明策略將光毒性降至最低，適合長期活體觀測。此外，MFIAS兼容反射和熒光模式，可擴展至植物靜脈成像或昆蟲翅膀觀察等應(yīng)用場景。

技術(shù)的經(jīng)濟(jì)性和易用性也是亮點之一：系統(tǒng)基于商用組件構(gòu)建，成本較低，且可通過多盤設(shè)計（如“時-分-秒”盤組合）擴展景深，滿足不同實驗需求。這種靈活性使其在臨床診斷和基礎(chǔ)研究中具有廣泛應(yīng)用潛力。

總結(jié)與展望
MFIAS宏觀成像技術(shù)通過創(chuàng)新性的旋轉(zhuǎn)盤設(shè)計和選擇性照明策略，成功打破了傳統(tǒng)光學(xué)成像的壁壘，實現(xiàn)了對任意形狀表面的高速、高分辨率觀測。在活體小鼠腦實驗中，該技術(shù)不僅揭示了神經(jīng)活動和免疫細(xì)胞遷移的動態(tài)細(xì)節(jié)，還展示了其在多學(xué)科交叉研究中的通用性。盡管目前系統(tǒng)在穿透深度和表面檢測速度上存在局限，但通過集成光學(xué)切片算法和硬件加速，未來有望實現(xiàn)對更復(fù)雜生物過程的縱深探索。隨著技術(shù)的不斷優(yōu)化，MFIAS或?qū)⒊蔀樯�命科學(xué)領(lǐng)域不可或缺的成像平臺，為神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)乃至臨床診斷開辟新路徑。