基于雙物鏡光子增強(qiáng)顯微成像技術(shù)可無縫兼容多種模式

本項(xiàng)重要研究成果由Mark Tingey, Andrew Ruba, Samuel L. Junod, Coby Rush, Jason Saredy, William E. Brew和Weidong Yang共同完成。研究論文題為“Paired-objectives photon enhancement(POPE) microscopy: enhanced photon collection for fluorescence imaging”，已于2025年8月在《Communications Engineering》上正式在線發(fā)表。

重要發(fā)現(xiàn)
01核心光學(xué)原理與系統(tǒng)設(shè)計(jì)
POPE顯微鏡的核心貢獻(xiàn)在于其獨(dú)特的光學(xué)架構(gòu)，它直指傳統(tǒng)熒光顯微鏡光子收集效率低下的根源。在常規(guī)的倒置或正置顯微鏡中，單個(gè)物鏡只能收集樣本一側(cè)（通常是下方）發(fā)射的光子，其收集效率由數(shù)值孔徑?jīng)Q定，即使使用高數(shù)值孔徑物鏡，也僅能捕獲約四分之一的光子。POPE技術(shù)突破了這一限制，采用雙物鏡對稱設(shè)計(jì)：主物鏡（位于樣本下方）負(fù)責(zé)提供激發(fā)光并收集向下發(fā)射的熒光；而另一個(gè)與之匹配的副物鏡（位于樣本上方）則專門用于捕獲那些原本會損失掉的、向上發(fā)射的光子。

實(shí)現(xiàn)光子高效回收的關(guān)鍵是一個(gè)精密的4f光學(xué)中繼系統(tǒng)。該系統(tǒng)由副物鏡（作為第一透鏡，焦距f₁）和一個(gè)復(fù)合透鏡（焦距f₂）構(gòu)成，兩者間距為f₁ + f₂。此設(shè)計(jì)構(gòu)成了一個(gè)望遠(yuǎn)系統(tǒng)，能夠?qū)Σ东@的光子波前進(jìn)行傅里葉變換和逆變換，從而在保持波前空間完整性的前提下，將光子傳導(dǎo)至一個(gè)反射率超過99.99%的平面介電反射鏡上。光子經(jīng)反射后，沿原路返回，再次通過4f系統(tǒng)和主物鏡，最終與向下發(fā)射的光子在探測路徑上合并。整個(gè)過程中，一個(gè)戰(zhàn)略性地放置在透鏡間的長通濾光片用于阻擋激發(fā)光，防止其反射回去造成樣本的二次激發(fā)，從而有效隔離熒光信號并提升信噪比。這種閉循環(huán)設(shè)計(jì)確保了成像質(zhì)量達(dá)到衍射極限，且在整個(gè)視場和焦平面內(nèi)保持均勻。

定量分析表明，經(jīng)過完美對齊后，結(jié)合POPE的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)與單物鏡點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)在形狀上高度一致，其強(qiáng)度相關(guān)商數(shù)和皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.4和0.8以上，證明了卓越的空間重疊度。盡管合并后的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)在橫向和軸向上有輕微展寬（例如橫向半高全寬從約296納米增至320納米以內(nèi)），但其峰值強(qiáng)度卻實(shí)現(xiàn)了近兩倍的提升，這正是光子收集效率倍增的直接體現(xiàn)。這套系統(tǒng)的校準(zhǔn)流程確保了POPE顯微鏡能夠在最大化收集光子的同時(shí)，保持優(yōu)異的成像質(zhì)量。

04增強(qiáng)共聚焦與寬場成像能力
POPE技術(shù)的優(yōu)勢并不僅限于超分辨成像。在研究將其應(yīng)用于共聚焦激光掃描顯微鏡時(shí)，在成像熒光微球和表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞樣本中，POPE使檢測到的熒光信號強(qiáng)度提升了1.8至1.9倍，這直接提升了共聚焦圖像的信噪比和光學(xué)切片質(zhì)量。同樣，在寬場熒光成像模式下，對標(biāo)記了特定蛋白的細(xì)胞進(jìn)行成像，POPE也帶來了約1.5倍的信號提升。尤為值得一提的是，在自發(fā)熒光成像中，即不依賴任何外源熒光標(biāo)記、僅利用細(xì)胞內(nèi)源物質(zhì)（如黃素類分子）的微弱信號進(jìn)行成像時(shí)，POPE在多種細(xì)胞系中均實(shí)現(xiàn)了1.3至1.5倍的信號增強(qiáng)，這對于活細(xì)胞、無標(biāo)記觀察細(xì)胞代謝狀態(tài)等應(yīng)用具有重要價(jià)值。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
POPE顯微鏡最突出的創(chuàng)新價(jià)值在于，它以一種相對簡潔、模塊化且易于實(shí)施的方案，成功解決了熒光顯微鏡領(lǐng)域長期存在的“光子浪費(fèi)”這一根本性效率瓶頸。與那些需要復(fù)雜干涉光路、雙通道探測或精密圖像配準(zhǔn)的雙物鏡技術(shù)不同，POPE的核心創(chuàng)新點(diǎn)在于巧妙地利用4f光學(xué)中繼系統(tǒng)和反射鏡，實(shí)現(xiàn)了將“損失”的光子高效回收并導(dǎo)入單一、標(biāo)準(zhǔn)的探測路徑。這種設(shè)計(jì)哲學(xué)使其在提供高達(dá)兩倍光子收集能力的同時(shí)，最大程度地降低了對現(xiàn)有顯微鏡平臺的改造難度和成本，使其成為一種極具實(shí)用價(jià)值和推廣潛力的“即插即用”式升級方案。

在技術(shù)層面，POPE的亮點(diǎn)在于其卓越的兼容性。它并非一種獨(dú)立的成像模式，而是一個(gè)通用的信號增強(qiáng)平臺。研究表明，它能夠顯著提升從納米精度的單分子定位成像，到常規(guī)的共聚焦和寬場成像，乃至極具挑戰(zhàn)性的自發(fā)熒光成像等多種技術(shù)的性能。這種“一專多能”的特性，意味著一個(gè)實(shí)驗(yàn)室只需添加POPE模塊，就能使其核心成像設(shè)備在多種應(yīng)用場景下獲得性能飛躍，特別是在信噪比提升和成像速度加快方面，這對于觀察快速生命過程或研究光敏感樣本尤為重要。

從應(yīng)用價(jià)值來看，POPE技術(shù)的意義深遠(yuǎn)。它直接提升了熒光成像的靈敏度極限，使得研究者能夠探測到更微弱信號，從而可能觀察到以往難以窺見的生物現(xiàn)象。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這可以轉(zhuǎn)化為更清晰的疾病相關(guān)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖像、更精確的活細(xì)胞內(nèi)分子動(dòng)力學(xué)追蹤，以及更高質(zhì)量的原位組織分析。此外，通過提升自發(fā)熒光成像能力，POPE為無標(biāo)記、非侵入性的長期活細(xì)胞監(jiān)測提供了新可能，這在藥物篩選和細(xì)胞代謝研究中有廣闊前景。最后，論文還前瞻性地指出，POPE的基本架構(gòu)為未來進(jìn)一步升級（如與雙光子激發(fā)結(jié)合以提升穿透力，或改造為干涉測量模式以提升分辨率）預(yù)留了空間，展現(xiàn)出持續(xù)的技術(shù)生命力。

總結(jié)與展望
綜上所述，POPE顯微鏡通過一種創(chuàng)新性的雙物鏡光子回收設(shè)計(jì)，成功地將熒光成像的光子收集效率提升至傳統(tǒng)方法的近兩倍。這項(xiàng)技術(shù)的核心優(yōu)勢在于其模塊化、高兼容性和易用性，能夠作為一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)高效的升級方案廣泛應(yīng)用于現(xiàn)有的倒置顯微鏡平臺，并顯著增強(qiáng)包括超分辨顯微鏡、共聚焦顯微鏡、寬場熒光顯微鏡以及自發(fā)熒光顯微鏡在內(nèi)的多種成像模式的性能。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)充分證明，POPE能夠在從簡單溶液樣本到復(fù)雜厚組織的一系列生物應(yīng)用中，有效改善圖像的信噪比、空間分辨率和采集速度。

POPE技術(shù)擁有令人興奮的發(fā)展前景。下一步的研究方向可能包括將其與多光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合，以更好地克服生物組織中的光散射問題，從而實(shí)現(xiàn)對更厚樣本（如類器官、全胚胎等）的高質(zhì)量深層成像。此外，通過移除非必需的光學(xué)濾片并優(yōu)化光路，POPE系統(tǒng)有潛力演變?yōu)轭愃?Pi的干涉測量系統(tǒng)，從而在進(jìn)一步提升光子收集效率的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)軸向分辨率的納米級銳化。隨著技術(shù)的不斷優(yōu)化和普及，POPE有望成為生物醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室的一種標(biāo)準(zhǔn)配置，通過釋放熒光成像的全部潛力，為生命科學(xué)研究和臨床診斷提供更加強(qiáng)大的觀察工具，最終推動(dòng)我們在細(xì)胞和分子水平上對生命過程的理解。

DOI:10.1038/s44172-025-00491-6