文獻(xiàn)解析：MTAP缺失使人類癌細(xì)胞更依賴精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT5

MTAP deletion confers enhanced dependency on the PRMT5 arginine methyltransferase in cancer cells

今日要講解的文獻(xiàn)，同樣基于合成致死原理，致力于迅速確定在MTAP缺失的癌癥中與MTAP相關(guān)的合成致死基因，隨后通過(guò)抑制這些基因的功能來(lái)更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞。關(guān)于該研究發(fā)現(xiàn)的文獻(xiàn)共有三篇，其中兩篇由兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室于2016年3月11日聯(lián)合發(fā)表在《Science》雜志上，另一篇?jiǎng)t于2016年4月19日發(fā)表于《Cell Reports》雜志。本次匯報(bào)的內(nèi)容聚焦于其中一篇刊登在《Science》上的文章。（MTAP deletion confers enhanced dependency on the PRMT5 arginine methyltransferase in cancer cells）

甲基硫腺苷磷酸化酶（MTAP）的基因在正常組織內(nèi)廣泛表達(dá)。但因其與CDKN2A（一種最常見(jiàn)的缺失型腫瘤抑制基因）位置相鄰，所以在癌癥中MTAP的純合缺失現(xiàn)象較為普遍（見(jiàn)圖1A）。MTAP酶負(fù)責(zé)裂解甲基硫腺苷（MTA），產(chǎn)生用于蛋氨酸和腺嘌呤循環(huán)利用途徑的前體物質(zhì)。

為了探尋與MTAP缺失相關(guān)的遺傳弱點(diǎn)，研究者們借助了基因組規(guī)模的短發(fā)夾RNA（shRNA）篩選數(shù)據(jù)，對(duì)來(lái)自Achilles項(xiàng)目的216個(gè)癌細(xì)胞系進(jìn)行了深入分析。他們結(jié)合癌癥細(xì)胞系百科全書(shū)中的MTAP拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，確定了每個(gè)細(xì)胞系的MTAP缺失狀態(tài)。通過(guò)對(duì)比50,529個(gè)shRNA的敏感性譜與MTAP缺失狀態(tài)，研究者們鑒別出了兩個(gè)特定的shRNA，它們與MTAP缺失株系（MTAP-，n=50）的生存能力下降密切相關(guān)，而與MTAP陽(yáng)性株系（MTAP+）則無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（見(jiàn)圖1B）。其中一個(gè)shRNA針對(duì)的是PRMT5基因，另一個(gè)則針對(duì)WDR77基因。值得注意的是，MTAP-細(xì)胞株不僅對(duì)針對(duì)PRMT5的shRNA敏感，同時(shí)也對(duì)針對(duì)WDR77的shRNA敏感（見(jiàn)圖1C）。與CDKN2A和MTAP同時(shí)缺失的細(xì)胞系相比，僅CDKN2A缺失而非MTAP缺失的細(xì)胞系對(duì)PRMT5或WDR77缺失的敏感性普遍較低，這進(jìn)一步證實(shí)了這種敏感性與MTAP缺失而非CDKN2A缺失的關(guān)聯(lián)（見(jiàn)圖1D）。為了強(qiáng)化這一發(fā)現(xiàn)，研究者們還從篩選數(shù)據(jù)集中檢測(cè)了針對(duì)PRMT5和WDR77的額外shRNA，并鑒定出了第二個(gè)針對(duì)PRMT5（shPRMT5 #2）和WDR77（shWDR77 #2）的shRNA，它們同樣證明了細(xì)胞活力受損與MTAP缺失之間存在強(qiáng)烈的相關(guān)性（見(jiàn)圖1E）。同時(shí)，研究者們也排除了假陽(yáng)性結(jié)果的可能性。

PRMT5和WDR77是催化蛋白甲基化的關(guān)鍵組分，它們形成復(fù)合物，催化甲基轉(zhuǎn)移到靶蛋白的精氨酸側(cè)鏈上，這些靶蛋白包括參與染色質(zhì)重塑和基因表達(dá)的組蛋白，以及參與mRNA加工的RNA結(jié)合蛋白Sm蛋白。此前已有研究報(bào)道，PRMT5的基因耗竭可通過(guò)誘導(dǎo)G1細(xì)胞周期阻滯和凋亡來(lái)?yè)p害癌細(xì)胞的活力。有趣的是，針對(duì)PRMT5或WDR77的shRNA都降低了這兩種蛋白的水平（盡管它們對(duì)靶轉(zhuǎn)錄本具有特異性抑制作用），這與使用任何一種shRNA都能耗盡甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的觀察結(jié)果相一致。此外，MTAP-細(xì)胞還對(duì)shRNA介導(dǎo)的CLNS1A和RIOK1缺失敏感，這兩種基因編碼甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的另外兩種成分（見(jiàn)圖1E）。最后，在細(xì)胞譜系中也證實(shí)了MTAP缺失與對(duì)PRMT5或WDR77抑制的敏感性之間的相關(guān)性。在包括膠質(zhì)瘤、胰腺腺癌和非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的個(gè)體譜系中，MTAP-細(xì)胞系通常（盡管并非普遍）比MTAP+細(xì)胞系對(duì)PRMT5和WDR77的耗竭更為敏感（見(jiàn)圖1F）。

基于上述觀察結(jié)果，研究者們推測(cè)MTAP缺失可能會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)PRMT5和WDR77基因抑制的敏感性。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，他們檢測(cè)了針對(duì)PRMT5和WDR77的shRNA對(duì)另外275種癌癥細(xì)胞系的細(xì)胞活力的影響。這些數(shù)據(jù)是使用一個(gè)擴(kuò)展的shRNA庫(kù)生成的，其中包含了初始研究中未涵蓋的shRNA。與最初篩選數(shù)據(jù)集的結(jié)果相似，他們觀察到MTAP-株系（n=47）通常比MTAP+株系對(duì)PRMT5或WDR77的抑制更為敏感（見(jiàn)圖1G）�？傮w而言，MTAP-細(xì)胞對(duì)PRMT5或WDR77耗竭的敏感性增強(qiáng)，這一結(jié)論是通過(guò)5個(gè)shRNA（其中3個(gè)靶向PRMT5，2個(gè)靶向WDR77）在來(lái)自491個(gè)癌細(xì)胞株的兩個(gè)獨(dú)立功能數(shù)據(jù)集中得到的驗(yàn)證。

為了探究MTAP對(duì)PRMT5或WDR77抑制下細(xì)胞活性的影響，研究團(tuán)隊(duì)首先將MTAP基因引入四個(gè)MTAP缺失的細(xì)胞系中，這些細(xì)胞系分別是LU99和H647（均屬于非小細(xì)胞肺癌），SF-172（膠質(zhì)瘤細(xì)胞系），以及SU.86.86（胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞系）。結(jié)果顯示，在MTAP重組的細(xì)胞系中，MTAP蛋白得到了顯著表達(dá)，而相應(yīng)的親本細(xì)胞系中則未檢測(cè)到MTAP的表達(dá)（見(jiàn)圖2A）。

隨后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了菌落形成試驗(yàn)，以評(píng)估在MTAP存在與否的情況下，PRMT5或WDR77耗盡對(duì)細(xì)胞活力的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，每個(gè)MTAP缺失的細(xì)胞系在PRMT5或WDR77受到抑制后，其細(xì)胞活力均有所下降，這與之前的篩選和驗(yàn)證結(jié)果保持一致（見(jiàn)圖2B,C）�？傮w而言，當(dāng)MTAP被重新導(dǎo)入到MTAP缺失的細(xì)胞系后，這些細(xì)胞對(duì)PRMT5或WDR77抑制的敏感性顯著降低。這一發(fā)現(xiàn)揭示了MTAP缺失與細(xì)胞對(duì)PRMT5或WDR77依賴性之間的功能聯(lián)系（見(jiàn)圖2B,C）。

先前的研究已經(jīng)指出，PRMT蛋白的活性可能會(huì)受到MTA（即MTAP的底物）的抑制。MTA作為s-腺苷蛋氨酸（SAM，PRMT5介導(dǎo)甲基化過(guò)程中的供體底物）的類似物，可能對(duì)PRMT5的活性產(chǎn)生影響�；�于這些發(fā)現(xiàn)，我們提出了一個(gè)假設(shè)：細(xì)胞中MTAP的缺失可能會(huì)導(dǎo)致MTA濃度的上升，進(jìn)而對(duì)PRMT5的活性產(chǎn)生部分抑制作用。綜上所述，這些效應(yīng)可能會(huì)使細(xì)胞對(duì)PRMT5活性的進(jìn)一步降低變得更加敏感，例如通過(guò)基因抑制的方式。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究團(tuán)隊(duì)首先探究了MTAP缺失的細(xì)胞是否含有較高的MTA水平。他們利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）技術(shù)，對(duì)來(lái)自LU99、H647、SF-172和SU.86.86細(xì)胞系以及這些細(xì)胞系導(dǎo)入MTAP后的56種代謝物（包括MTA）進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示，大多數(shù)代謝物的豐度并未因MTAP的異位表達(dá)而發(fā)生顯著變化（見(jiàn)圖3A）。然而，當(dāng)MTAP被導(dǎo)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)MTA的豐度降低了1.5到6倍，這與MTAP缺失時(shí)細(xì)胞內(nèi)MTA濃度增加的觀察結(jié)果相吻合（見(jiàn)圖3A-C）。

為了進(jìn)一步確認(rèn)MTAP缺失的細(xì)胞株中MTA水平是否普遍高于MTAP存在的細(xì)胞株，研究團(tuán)隊(duì)量化了來(lái)自不同細(xì)胞系的19個(gè)MTAP缺失（MTAP-）和21個(gè)MTAP存在（MTAP+）的癌細(xì)胞株的73種代謝物的細(xì)胞內(nèi)水平，這些細(xì)胞系涵蓋了非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤和乳腺癌。在代謝譜中，MTA的豐度與MTAP的缺失狀態(tài)呈現(xiàn)出最強(qiáng)的相關(guān)性（見(jiàn)圖3D）。結(jié)果顯示，MTAP缺失的細(xì)胞系中MTA的中位水平比MTAP存在的細(xì)胞系增加了約3.3倍，這與我們關(guān)于MTAP缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MTA增加的假設(shè)相一致（見(jiàn)圖3E）。

此外，研究團(tuán)隊(duì)還利用來(lái)自Achilles項(xiàng)目的shRNA敏感性數(shù)據(jù)，觀察到了MTA水平與PRMT5依賴性之間的顯著相關(guān)性（見(jiàn)圖3F）。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了我們的假設(shè)，即MTAP的缺失可能通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)MTA的水平來(lái)影響PRMT5的活性，從而使細(xì)胞對(duì)PRMT5活性的進(jìn)一步降低變得更加敏感。

接下來(lái)，研究者深入探究了MTA水平升高是否會(huì)對(duì)PRMT5的活性產(chǎn)生抑制作用。PRMT5作為一種特定的甲基轉(zhuǎn)移酶，主要負(fù)責(zé)催化對(duì)稱二甲基精氨酸（sDMA）的形成，而PRMT家族中的其他大多數(shù)成員則催化不對(duì)稱二甲基精氨酸（aDMA）的形成。通過(guò)使用一種能夠特異性識(shí)別PRMT5產(chǎn)生的sDMA的抗體，研究者發(fā)現(xiàn)，與重新導(dǎo)入MTAP的細(xì)胞相比，MTAP缺失的細(xì)胞中sDMA的水平有所下降（見(jiàn)圖4A）。此外，當(dāng)MTAP重新導(dǎo)入的細(xì)胞暴露于外源性MTA時(shí)，也觀察到了sDMA水平的減少，這與PRMT5酶活性受到抑制的現(xiàn)象相一致（見(jiàn)圖4A）。類似的結(jié)果也在使用能夠識(shí)別PRMT5催化產(chǎn)物H4精氨酸3（H4R3）對(duì)稱甲基化的抗體上得到了驗(yàn)證（見(jiàn)圖4A）。相比之下，研究者發(fā)現(xiàn)MTAP的狀態(tài)或外源性MTA對(duì)aDMA水平的影響并不顯著（見(jiàn)圖4A）。

這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步增強(qiáng)了PRMT家族成員中PRMT5對(duì)細(xì)胞內(nèi)MTA濃度敏感性增高的可能性。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究者采用了放射性同位素過(guò)濾結(jié)合分析方法，對(duì)MTA抑制31種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（包括PRMT5和PRMT5/WDR77復(fù)合物）催化功能的能力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，MTA對(duì)PRMT5和PRMT5/WDR77活性的選擇性抑制效果超過(guò)了其他甲基轉(zhuǎn)移酶100倍，這與PRMT5功能容易受到MTA濃度升高抑制的假設(shè)相吻合（見(jiàn)圖4B）。此外，研究者還證實(shí)MTA是一種SAM競(jìng)爭(zhēng)性的PRMT5抑制劑。

隨后，研究者試圖確定MTAP缺失的細(xì)胞株是否比MTAP存在的細(xì)胞株對(duì)藥物抑制PRMT5表現(xiàn)出更高的敏感性。他們鑒定了兩種具有明確PRMT5結(jié)合位點(diǎn)的抑制劑：代謝物MTA和EPZ015666。其中，EPZ015666是一種有效的多肽競(jìng)爭(zhēng)和SAM協(xié)同抑制劑，相對(duì)于其他甲基轉(zhuǎn)移酶，它對(duì)PRMT5具有10,000倍的特異性。研究者測(cè)試了這些抑制劑對(duì)MTAP缺失的細(xì)胞系、重新導(dǎo)入MTAP的MTAP缺失細(xì)胞系、MTAP存在的細(xì)胞系以及通過(guò)CRISPR技術(shù)介導(dǎo)MTAP敲除的MTAP存在細(xì)胞系的選擇性損傷能力。在11對(duì)同基因細(xì)胞系中，MTA或EPZ015666處理的MTAP缺失細(xì)胞系的IC50值普遍低于重新導(dǎo)入MTAP的MTAP缺失細(xì)胞系的IC50值，這與從PRMT5基因耗盡實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果相一致（盡管效應(yīng)大小相對(duì)較�。�（見(jiàn)圖4C, D）。

綜上所述，研究結(jié)果顯示，MTAP的缺失會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)MTA水平的上升，這一變化進(jìn)而抑制PRMT5的活性，并增加了細(xì)胞對(duì)PRMT5進(jìn)一步功能衰竭的敏感性。盡管PRMT5近期已成為某些癌癥潛在的治療靶點(diǎn)，但先前尚未發(fā)現(xiàn)與PRMT5抑制敏感性相關(guān)的基因變異。本研究的數(shù)據(jù)揭示，盡管MTAP缺失（MTAP-）和MTAP存在（MTAP+）的細(xì)胞系對(duì)PRMT5或WDR77抑制的敏感性存在重疊，但眾多MTAP-的腫瘤對(duì)甲基酶復(fù)合體的耗損表現(xiàn)出更高的敏感性（見(jiàn)圖1D, F, G）。因此，僅憑MTAP的狀態(tài)并不足以準(zhǔn)確區(qū)分對(duì)PRMT5抑制敏感的細(xì)胞系。這些觀察結(jié)果提示，存在其他修飾因子，它們以獨(dú)立于MTAP狀態(tài)的方式影響著甲基酶體耗損的敏感性。盡管如此，本研究的結(jié)果支持了一個(gè)出乎意料的觀點(diǎn)，即MTAP缺失的細(xì)胞對(duì)PRMT5的損耗具有敏感性。更廣泛地講，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了大型癌癥細(xì)胞系集合在全面功能和分子特性分析方面的價(jià)值，這對(duì)于識(shí)別由常見(jiàn)遺傳病變所賦予的潛在靶向依賴性至關(guān)重要。