HDAC抑制劑的分類、作用機制及相關(guān)藥物研發(fā)策略全解析

二、HDAC抑制劑
當(dāng)HDAC異常高表達時，許多抑癌基因被“沉默”，為腫瘤細胞生長提供了便利。HDAC抑制劑通過阻斷HDAC的活性，恢復(fù)基因的乙�；�水平，重新激活這些被壓制的基因，參與調(diào)控了很多細胞因子和生物標(biāo)志物。

2、細胞因子&生物標(biāo)志檢測
（1）THUNDER TR-FRET方法

（2）OneStep ELISA細胞因子檢測
OneStep ELISA開發(fā)標(biāo)簽抗體捕獲技術(shù)，板底包被標(biāo)簽抗體，可高靈敏捕獲雙抗夾心復(fù)合物，搭配高特異性重組單抗，一步即可在溶液中形成抗體-分析物夾心復(fù)合物�？奢p松準(zhǔn)確定量蛋白。僅需1h，即可定量細胞因子。

3、信號通路磷酸化蛋白檢測
p-Akt、f NF-B也是由HDAC抑制劑一致調(diào)控的細胞因子，一些HDAC抑制劑會降低p-Akt和f NF-B水平。使用均相免洗免疫檢測技術(shù)，如TR-FRET，在大分子數(shù)據(jù)庫中快速篩選潛在候選分子。

（1）THUNDER TR-FRET 磷酸化蛋白檢測
THUNDER TR-FRET時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移，檢測技術(shù)靈敏度高，特異性好，重復(fù)性好，操作簡單，僅需1~4h。一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時間分辨熒光（TRF, Time-Resolved Fluorescence）的技術(shù)，采用夾心法，檢測胞內(nèi)AKT磷酸化水平和總AKT水平。

用IGF-1處理MCF7細胞（60000個細胞/孔）與IGF-1在室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，不同酶標(biāo)儀對信號的影響。用LY294002、Wortmannin和S961處理MCF7細胞（60000個/孔），在室溫下孵育30分鐘，然后用1µM胰島素刺激細胞，在室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，LY294002和Wortmannin可以抑制AKT蛋白S473位點的磷酸化，而S961則無抑制效果。

（2）WB方法檢測
以Phospho-NF-κB為例
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 抗體采用1/1000稀釋， HELA細胞100 ng/ml Calyculin A處理30分鐘， TNF-α 20 ng/ml 處理5分鐘，Goat Anti-rabbit IgG, (H+L), HRP 采用1/10000稀釋，上樣檢測，數(shù)據(jù)展示如下。

4、殺傷功能檢測——GRANZYME B
HDAC抑制劑可以使Granzyme B增加。
THUNDER Biomarker檢測是基于雙抗體夾心法，標(biāo)記熒光供體和受體的Granzyme B抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細胞上清中Granzyme B 結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進而產(chǎn)生665nm熒光信號，熒光信號強度與Granzyme B濃度成正比。全程僅需2h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。

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