利用自組裝納米體白蛋白平臺封裝染料進行NIR-II成像引導的光動力治療
本文要點：本研究開發(fā)了一種腫瘤靶向納米抗體平臺，通過白蛋白結合和染料封裝實現(xiàn)近紅外二區(qū)（NIR-II）成像引導的光動力治療。該平臺通過基因工程改造納米抗體使其與人血清白蛋白（HSA）特異性結合，形成單分散遞送載體。白蛋白空腔封裝IR808染料后，在808 nm激光激發(fā)下可同步增強NIR-II熒光與單線態(tài)氧生成。這種親和力驅動的自組裝技術構建了均質性納米抗體-白蛋白復合平臺，其中白蛋白結合使納米抗體藥代動力學顯著改善，腫瘤蓄積量遠超清除器官滯留量。在結直腸癌移植瘤模型中，僅需420 J/cm²的低劑量近紅外光照射即可實現(xiàn)高對比度NIR-II成像與高效光動力治療。該研究凸顯了自組裝納米抗體平臺的生物衍生特性與卓越療效，為設計精準診療劑提供了新策略。
本文研發(fā)了一種腫瘤靶向納米抗體平臺，該平臺通過白蛋白與染料結合進行封裝，利用近紅外二區(qū)（NIR-II）成像引導光動力治療。構建腫瘤靶向納米抗體-白蛋白平臺的策略如方案1所示。前期研究表明，通過基因工程引入白蛋白結合結構域（ABD）的納米抗體可借助內源性白蛋白結合延長血液循環(huán)時間。本研究利用納米抗體-白蛋白結合與白蛋白-染料封裝技術，組裝出用于NIR-II成像引導光動力治療的診療一體化平臺。研究者篩選了兩種近紅外花菁染料（含氯IR808與無氯ICG）進行HSA封裝，并系統(tǒng)考察HSA-染料探針的光物理性質。值得注意的是，在近紅外光激發(fā)下，該染料的熒光亮度、光穩(wěn)定性及單線態(tài)氧生成效率均獲得顯著提升。荷瘤小鼠模型體內實驗顯示，相較于單純白蛋白遞送系統(tǒng)，該納米抗體平臺具有顯著的腫瘤靶向蓄積特性，光動力治療效果大幅增強。本研究為開發(fā)兼具高特異性與高載藥能力的生物基診療一體化平臺提供了創(chuàng)新方案。
方案1. NIR-II成像和光動力治療的具有增強熒光亮度和單線態(tài)氧產生的腫瘤靶向納米體HSA治療平臺的構建示意圖
染料與HSA按不同分子比在50℃孵育2小時完成封裝（圖1a），采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析不同摩爾比的HSA-染料復合物。由于SDS-PAGE會使蛋白質變性并破壞白蛋白疏水腔結構，該方法可有效表征染料封裝機制。如圖1b所示，HSA-IR808電泳條帶呈現(xiàn)強烈熒光信號，證實IR808與HSA形成穩(wěn)定復合物；而HSA-ICG條帶熒光信號可忽略，表明其在SDS-PAGE處理過程中發(fā)生解離。該現(xiàn)象與既往研究一致：含氯菁染料可通過與疏水腔內半胱氨酸殘基共價結合，形成穩(wěn)定熒光復合物。值得注意的是，當IR808與HSA摩爾反應比為2:1時，HSA-IR808復合物熒光強度達到峰值，提示白蛋白空腔達到染料封裝飽和。最終選擇2:1摩爾比的HSA-IR808復合物進行后續(xù)研究。
采用紫外-可見吸收光譜和熒光光譜對HSA-IR808復合物的光物理性質進行表征。紫外-可見光譜顯示，與游離IR808相比，HSA-IR808復合物的吸收峰出現(xiàn)20 nm的紅移，且溶液顏色因近紅外吸收增強而發(fā)生顯著變化（圖1c）。熒光光譜中同樣觀察到發(fā)射紅移，且熒光強度大幅提升（圖1d）。這一現(xiàn)象歸因于染料分子與白蛋白Trp214殘基之間形成大π-π共軛體系，降低了最高占據(jù)分子軌道-最低未占據(jù)分子軌道（HOMO-LUMO）能隙，從而誘導吸收波長紅移。此外，研究表明白蛋白對水溶液中的菁染料具有雙重保護作用，既能防止聚集，又可限制光照下的光氧化裂解反應。基于此效應，本文考察了HSA-IR808在連續(xù)激光照射下的光穩(wěn)定性。實驗發(fā)現(xiàn)，10分鐘激光照射后，游離IR808的熒光強度降至初始值的10%左右，而HSA-IR808仍保持75%以上的熒光強度（圖1e），表明其光穩(wěn)定性顯著改善。綜上，白蛋白封裝可有效提升近紅外染料熒光亮度與光穩(wěn)定性。接著研究者進一步探究了白蛋白封裝對菁染料單線態(tài)氧生成及光動力治療效果的影響。采用單線態(tài)氧熒光探針（SOSG）檢測發(fā)現(xiàn)，在808 nm激光照射下，HSA-IR808溶液中的SOSG熒光強度在120秒內顯著增強（圖1f），表明封裝染料能有效產生單線態(tài)氧；而游離IR808和ICG溶液中的SOSG熒光僅微弱增加（圖1g、1h），PBS對照組則無變化。定量分析顯示，白蛋白封裝使單線態(tài)氧生成效率提升至游離IR808的3倍（圖1i），其量子產率達到約0.5%。
盡管白蛋白封裝能顯著提升熒光團的亮度、穩(wěn)定性和單線態(tài)氧生成能力，但天然白蛋白載體在體內常面臨腫瘤靶向性不足的挑戰(zhàn)。前期開發(fā)的抗CD47納米抗體-白蛋白結合域融合蛋白（Nb-ABD）能通過結合白蛋白延長納米抗體的體內半衰期，其對多種白蛋白亞型均表現(xiàn)出強結合親和力，其中對人血清白蛋白（HSA）的親和力最高。本研究利用這一特性，通過Nb-ABD與HSA-IR808分子的自組裝構建納米抗體-白蛋白平臺（Nb-HSA-IR808）（圖2a）。采用分子排阻色譜（SEC）分析1:1摩爾比的Nb-ABD與HSA復合情況，結果顯示在50 mL保留體積處出現(xiàn)單一蛋白峰（圖2b），其分子量大于游離HSA；而2:1混合體系則同時存在Nb-HSA復合物和游離Nb-ABD。穩(wěn)定性實驗表明，Nb-HSA復合物在PBS或50%胎牛血清（FBS）中37℃孵育48小時后，PBS組保持完全復合狀態(tài)，50% FBS組復合率仍超過90%（圖2c）。動態(tài)光散射（DLS）檢測顯示Nb-HSA復合物粒徑較游離HSA略有增大（圖2d），與SEC結果一致，證實該平臺具有高效自組裝性、產物均一性和生理環(huán)境穩(wěn)定性。
為驗證平臺的腫瘤靶向性，采用FITC標記HSA構建熒光探針（Nb-HSA-FITC），SEC證實Nb-ABD與HSA-FITC成功結合。以CD47高表達的人結直腸癌LS174T細胞為模型，共聚焦顯微鏡顯示僅Nb-HSA-FITC組細胞呈現(xiàn)顯著綠色熒光（圖2e）；而預先用游離納米抗體封閉的對照組熒光信號與無靶向性的HSA-FITC組相當，表明納米抗體修飾可增強靶向特異性。流式細胞術進一步證實Nb-HSA-FITC組的平均熒光強度顯著高于對照組（圖2f、2g）。值得注意的是，HSA-FITC組及納米抗體封閉組仍表現(xiàn)出中等熒光增強，提示癌細胞存在非特異性白蛋白攝取，但Nb-HSA探針展現(xiàn)出明確的靶向優(yōu)勢。
圖3. Nb-HSA-IR808探針的體外細胞光毒性測定
研究者隨后通過將癌細胞與IR808、HSA-IR808和Nb-HSA-IR808共培養(yǎng)，評估了納米抗體-白蛋白探針的光動力效應。在無光照條件下，三種探針在0-20 μM濃度范圍內均未表現(xiàn)出顯著細胞毒性（圖3a）。但經(jīng)808 nm激光照射10分鐘后，觀察到明顯的濃度依賴性光毒性效應（圖3b）。當濃度超過10 μM時，Nb-HSA-IR808處理組的光毒性顯著高于游離IR808或HSA-IR808組，證實納米抗體靶向作用增強了光動力療效�；�/死細胞染色結果與細胞活性檢測一致：無光照時各組細胞均保持高活性（圖3c）；激光照射后，Nb-HSA-IR808組顯示出最強烈的死細胞信號。PBS對照組在光照后仍維持高細胞存活率，排除了實驗所用激光劑量本身的細胞毒性。結果共同證明，Nb-HSA-IR808探針在光動力治療領域具有重要應用潛力。
圖4. Nb-HSA探針的體內生物分布和藥代動力學
由于分子量較小，游離納米抗體易通過腎臟快速清除，導致體內循環(huán)時間較短（51,52）。研究者通過小鼠模型研究了納米抗體-白蛋白平臺的藥代動力學和生物分布特性。首先采用Cy5.5-NHS酯標記Nb-ABD蛋白并組裝成Nb-Cy5.5-HSA探針。活體熒光成像顯示（圖4a），靜脈注射Nb-Cy5.5-HSA的小鼠在5分鐘內即出現(xiàn)明顯的肝臟富集，而游離Nb-Cy5.5主要蓄積于膀胱區(qū)域。定量分析表明，注射后6小時內Nb-Cy5.5-HSA組的肝臟信號強度顯著高于游離納米抗體組（圖4b、4c）。離體器官成像進一步證實，注射6小時后Nb-Cy5.5-HSA主要分布于肝臟，而游離納米抗體則集中于腎臟（圖4d、4e）。藥代動力學監(jiān)測顯示，HSA結合使納米抗體的血漿半衰期從0.2小時延長至1.5小時，增幅達7.5倍（圖4f）。這些結果共同表明，白蛋白結合通過將納米抗體的清除途徑從腎臟快速排泄轉為肝臟代謝，顯著延長了其體內循環(huán)時間。
圖5. 皮下LS174T腫瘤小鼠的熒光成像
本研究采用結直腸癌異種移植小鼠模型，評估了Nb-HSA-IR808探針的體內腫瘤靶向能力。在靜脈注射等染料濃度的IR808、HSA-IR808和Nb-HSA-IR808探針后，對荷瘤小鼠進行了24小時近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像監(jiān)測。如圖5a所示，三組動物的腫瘤部位熒光信號在12小時內持續(xù)增強，并在24小時內保持相對穩(wěn)定。值得注意的是，Nb-HSA-IR808組的腫瘤信號強度較游離IR808和HSA-IR808組提高1.5倍（圖5b）。HSA-IR808與游離IR808在腫瘤部位的信號強度相近，可能與血液中內源性白蛋白對IR808的包裹作用有關。Nb-HSA-IR808組的腫瘤-肌肉信號比值較其他兩組高出1.6倍以上（圖5c），凸顯了該探針在熒光引導光動力治療中優(yōu)異的NIR-II成像對比度。離體器官成像顯示（圖5d、5e），三種探針在主要臟器的分布相似，但Nb-HSA-IR808在腫瘤組織的信號強度比游離IR808和HSA-IR808高約1.6倍。尤為重要的是，Nb-HSA-IR808組腫瘤的熒光信號甚至超過肝臟、腎臟等清除器官，充分證明納米抗體-白蛋白平臺卓越的腫瘤靶向性能。腫瘤組織的免疫組化結果（圖5f）顯示CD47高表達，為納米抗體探針的高靶向特異性提供了分子基礎。
圖6. Nb-HSA-IR808探針體內抗腫瘤療效評價
本文在結直腸癌異種移植模型中評估了Nb-HSA-IR808探針的光動力治療效果。將5×106個LS174T細胞皮下接種至每只Balb/c裸鼠體內，待腫瘤體積達到約80 mm³時，將小鼠隨機分為五組，分別靜脈注射游離IR808、HSA-IR808和Nb-HSA-IR808探針（400 μM IR808當量劑量，100μL）。注射12小時后，使用808 nm激光（0.7 W/cm²）照射腫瘤部位10分鐘（圖6a）。治療過程中實時監(jiān)測腫瘤部位溫度，始終維持在42℃以下以避免潛在的光熱效應（溫度超過42℃通常會造成不可逆組織損傷）。如圖6b所示，PBS組和游離IR808組在激光照射下均未顯示腫瘤抑制效果；未接受光照的Nb-HSA-IR808組與PBS組及游離IR808組腫瘤生長曲線相似，證實探針本身無抑瘤作用。而Nb-HSA-IR808聯(lián)合激光照射組展現(xiàn)出最顯著的治療效果——單次靜脈注射后僅需10分鐘近紅外光照射（0.7 W/cm²），14天內腫瘤體積較對照組縮小82%。值得注意的是，非靶向的HSA-IR808組僅表現(xiàn)中等抑瘤效果，凸顯了納米抗體靶向對療效的提升作用。離體腫瘤照片（圖6c）顯示Nb-HSA-IR808+激光組的腫瘤體積最小，平均重量僅為PBS+激光組的22%（圖6d）。該組小鼠14天存活率保持100%（圖6e），且所有組別小鼠體重均無顯著變化（圖6f），證實探針系統(tǒng)毒性極低。這些結果證明：白蛋白增強的單線態(tài)氧生成與納米抗體介導的腫瘤靶向具有協(xié)同增效作用，使Nb-HSA-IR808能以更低輻射劑量（420 J/cm²，遠低于文獻報道的600 J/cm²以上）實現(xiàn)優(yōu)異療效，展現(xiàn)出顯著的臨床轉化潛力。
研究者對各組小鼠腫瘤組織進行了病理學分析。H&E染色和免疫熒光結果顯示（圖6g），Nb-HSA-IR808聯(lián)合激光照射組的腫瘤切片呈現(xiàn)最顯著的壞死區(qū)域和強烈的細胞凋亡信號，證實該探針通過光動力效應有效誘導腫瘤細胞凋亡。為評估Nb-HSA-IR808的腎毒性風險，研究者檢測了注射前后小鼠血清尿素和肌酐水平。結果顯示：Nb-HSA-IR808組與PBS組在注射后72小時內各項指標均保持正常范圍（尿素：3.2-13.2 mmol/L；肌酐：11-28 μmol/L），證實該探針不會引發(fā)可檢測的腎損傷。綜上所述，Nb-HSA-IR808探針所有組分（納米抗體、白蛋白、IR808）均具有臨床使用基礎，使其成為兼具精準靶向能力、高效光動力活性和優(yōu)良生物安全性的診療一體化平臺。
本研究開發(fā)了一種基于基因工程納米抗體-白蛋白結合域（ABD）融合蛋白的自組裝納米抗體-白蛋白平臺，用于近紅外二區(qū)（NIR-II）成像引導的光動力治療。通過利用納米抗體-ABD與人血清白蛋白（HSA）的天然親和力，實現(xiàn)了納米抗體與白蛋白的特異性結合，有效克服了天然納米抗體易被腎臟快速清除的缺陷。同時，HSA作為多功能載體，其疏水腔可高效封裝IR808染料，顯著增強近紅外染料的理化特性和光動力療效。體外和體內實驗證實，該策略可顯著延長納米抗體-白蛋白復合物的血液循環(huán)時間，并實現(xiàn)腫瘤特異性富集，從而在808 nm激光照射下獲得高對比度的NIR-II成像和卓越的光動力治療效果。特別值得注意的是，Nb-HSA-IR808探針僅需420 J/cm²的低輻射劑量即可實現(xiàn)顯著療效，充分展現(xiàn)了生物源材料在臨床轉化中的巨大潛力。這種基于白蛋白結合域的自組裝策略可適配不同靶向納米抗體，為開發(fā)針對多種腫瘤標志物的精準診療制劑提供了通用技術路線。鑒于白蛋白與納米抗體優(yōu)異的生物相容性和臨床適用性，該研究為開發(fā)癌癥分子特異性診療平臺提供了兼具創(chuàng)新性和普適性的解決方案。
參考文獻
Yang, Y.; Zhang, Y.; Zhou, S.; Fang, X.; Zhang, X.; Wei, W.; Huang, G.; Wu, C., Self-Assembled Nanobody-Albumin Platform with Dye Encapsulation for NIR-II Imaging-Guided Photodynamic Therapy. ACS Applied Materials & Interfaces 2025,17 (31), 44249-44262.
⭐️ ⭐️ ⭐️
動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS
In Vivo Imaging System
高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um
熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us
高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）
多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、光聲和光熱成像、原位成像光譜，CT等
顯微鏡 - 高分辨顯微成像系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀
⭐️ ⭐️ ⭐️
恒光智影
上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評為“國家高新技術企業(yè)”、“上海市專精特新中小企業(yè)”，獲批主持“科技部重大儀器專項”子課題，榮獲上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”科學儀器項目、上海市2025年度關鍵技術研發(fā)計劃“計算生物學”項目。
恒光智影，致力于為生物醫(yī)學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供先進的、一體化的成像解決方案。
專注動物活體成像技術，成像范圍覆蓋 400-1700 nm，同時可整合CT, X-ray，超聲，光聲，光熱成像等技術。
可為腫瘤藥理、神經(jīng)藥理、心血管藥理、大分子藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學儀器服務。
