JAK激酶的信號通路及在WB檢測中獲得理想條帶的方法
JAK
JAK是細胞質(zhì)非受體酪氨酸激酶（Janus activated kinase，JAK）。它們最初被命名為“just another kinase”1和2（因為這只是基于PCR的篩選發(fā)現(xiàn)的大量激酶中的兩個），但最后發(fā)表為“Janus kinase”。Janus這個名字起自羅馬神話中代表開始與結(jié)束的兩面神雅努斯，因為JAK激酶具有兩個幾乎一樣的轉(zhuǎn)移磷酸基團的結(jié)構(gòu)域。其中一個結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出激酶活性，而另一個結(jié)構(gòu)域調(diào)控第一個激酶的活性。
1989年，Wilks等人確定酪氨酸激酶具有可識別的激酶結(jié)構(gòu)域和假激酶結(jié)構(gòu)域。1991年，他們發(fā)現(xiàn)了第二個具有這種特征的酪氨酸激酶，Wilks稱之為JAK1和JAK2。其他兩種JAKs，酪氨酸激酶2（TYK2）和JAK3，分別于1990年和1994年被鑒定出來。
1992年，當時Velazquez等人發(fā)現(xiàn)TYK2是IFN-α/β信號通路中的一種基本蛋白。而Müller等人發(fā)現(xiàn)，IFN依賴性信號需要JAK磷酸化STAT。因此，在90年代，JAK/STAT信號通路的組成部分和輪廓已經(jīng)完成。對JAK/STAT通路的更多蛋白質(zhì)和功能的研究一直持續(xù)到現(xiàn)在，目前JAK/STAT信號通路中已鑒定出50多種細胞因子和生長因子，如激素、干擾素、白細胞介素和集落刺激因子。
JAK/STAT信號通路
經(jīng)典的JAK/STAT信號通路是如何運轉(zhuǎn)的？首先是細胞配體與其受體相互作用，引起受體二聚體。一些受體可以在與配體結(jié)合之前預先形成非活性二聚體，這有助于受體復合物的快速組裝和信號轉(zhuǎn)導。配體和受體之間的連接誘導JAK的磷酸化。激活的JAK導致結(jié)合受體的酪氨酸磷酸化，形成STAT的結(jié)合位點。在這個位點，JAK磷酸化STAT，然后STAT與受體分離，形成同源二聚體或異二聚體。這些二聚體易位到靶基因啟動子，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。
圖1 JAK/STAT信號通路
那么我們介紹了這么多JAK，怎么樣才能在WB檢測中獲得理想的條帶呢？
01 確認好的研究對象
JAK家族包括四個成員：JAK1，JAK2，JAK3和TYK2， 他們的組織表達是有差異的，JAK3僅在骨髓和淋巴系統(tǒng)以及內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞中表達，而其他成員幾乎在所有組織中表達。這里請注意下，幾乎有表達≠所有組織高表達，組織間的差異我們也需要考慮。
如果碰到條帶較淡，可以適當增加上樣量。一般組織樣本上樣量推薦50-100ug，細胞樣本推薦上樣量為20-50ug。
有小伙伴問，我選好做哪個組織了，但是不知道研究哪個JAK，難道每個都要做嗎？其實不同的JAK激酶相互作用的細胞因子受體也有所不同，所涉及的疾病也有差異，可以根據(jù)圖2和圖3來選擇最佳的研究對象。
圖2 JAK相互作用的細胞因子受體
圖3 JAK突變或者異常表達可能導致的疾病
02 大分子量的電泳和轉(zhuǎn)膜
JAK家族的四個成員的分子量是不同的，JAK1-130 kDa，JAK2-125 kDa，JAK3-115 kDa，TYK2-134 kDa，都屬于大分子蛋白。大分子蛋白在WB實驗中是有一定難度的，因此在檢測時需要更加注重一些細節(jié)。
在電泳環(huán)節(jié)，建議分離凝膠濃度為6%-8%，或者選擇4-12%梯度膠，從而獲得更好的分離效果和分辨率。在轉(zhuǎn)膜環(huán)節(jié)，建議采用濕轉(zhuǎn)法，濕轉(zhuǎn)法可以保證大分子蛋白更加充分的轉(zhuǎn)印，圖4是濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)的效果對比。
圖4 濕轉(zhuǎn)與快速干轉(zhuǎn)效果對比
轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇濃度建議降低至10%以下，轉(zhuǎn)膜液中的甲醇容易讓大分子量蛋白沉淀，所以需要減少轉(zhuǎn)膜液中的甲醇含量來避免這種情況發(fā)生。另外，還可以在轉(zhuǎn)膜液中添加終濃度為0.1％的SDS，增加大分子蛋白的轉(zhuǎn)移效率。
轉(zhuǎn)膜條件應選擇較低的電壓并適當延長轉(zhuǎn)膜時間，推薦采用恒壓70V，轉(zhuǎn)膜2hr。轉(zhuǎn)膜全程在冰上低溫進行，避免因溫度升高導致轉(zhuǎn)膜效率降低。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后還可以使用麗春紅染液確認轉(zhuǎn)膜效率。
03 磷酸化檢測
在研究JAK時，我們一定也會檢測其磷酸化程度如何。前面我們提到JAK幾乎在所有組織都有表達，但是磷酸化就不一定了，需要合適的刺激誘導。我們一起來看下需要注意哪些細節(jié)：
❖使用新鮮樣本進行實驗，避免蛋白降解及去磷酸化發(fā)生。反復凍融的樣本很難檢測到磷酸化。
❖在制樣時需要對樣本進行適當?shù)?/span>刺激誘導處理，如果不知道用什么來刺激，可以根據(jù)圖2選擇合適的細胞因子來刺激。建議先進行預實驗，摸索不同濃度時間誘導處理后p-JAK表達水平的變化，選擇最佳條件進行后續(xù)實驗。摸時間和濃度梯度的預實驗結(jié)果比單點更具有說明力。
圖5 文獻中研究不同濃度的藥物對p-JAK2的影響
❖蛋白提取需全程在冰上進行，保持低溫，并加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以免蛋白發(fā)生去磷酸化。
❖建議先確認總蛋白的表達后，再做磷酸化的表達。磷酸化只是蛋白的一種修飾，如果總蛋白表達很低或者不表達，磷酸化是做不出來的。還可以通過上下游的磷酸化情況來綜合判斷，例如細胞因子受體的磷酸化，下游STAT的磷酸化等等。
以上是一些關(guān)于JAK的WB檢測Tips，當您一直重復實驗得不到理想結(jié)果時可以根據(jù)上述建議進行調(diào)整嘗試，可能一個小細節(jié)的改變就可以幫您得到理想的實驗結(jié)果。
以下推薦產(chǎn)品助力您的實驗：
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
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Phospho-Jak Family (Tyr1007/1008) (E9E4O) Rabbit mAb |
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Jak1 (6G4) Rabbit mAb |
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Jak2 (D2E12) XP Rabbit mAb |
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Jak3 (D1H3) Rabbit mAb |
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Phospho-Jak1 (Tyr1034/1035)/Jak2 (Tyr1007/1008) (E9Y7V) Mouse mAb |
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Phospho-Jak2 (Tyr1007) (D15E2) Rabbit mAb |
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Phospho-Jak3 (Tyr980/981) (D44E3) Rabbit mAb |
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JAK1 (8B8) Mouse mAb |
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JAK2 (7H5) Mouse mAb |
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Phospho-JAK2 (Tyr1007) Rabbit Polyclonal Antibody |
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Phospho-JAK2 (Tyr570) Rabbit Polyclonal Antibody |
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Phospho-JAK1 (Tyr1022) Rabbit Polyclonal Antibody |
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Phospho-JAK3 (Tyr981) Rabbit Polyclonal Antibody |
參考文獻：
[1] Bharath Kumar Gajjela, Ming-Ming Zhou. Calming the cytokine storm of COVID19 through inhibition of JAK2/STAT3 signaling. Drug Discov Today. 2022 Feb;27(2):390-400.
[2] W J Leonard, J J O'Shea. Jaks and STATs: biological implications. Annu Rev Immunol. 1998;16:293-322.
[3] Mamdooh A Gari. The Role of Janus Kinase 2 (JAK2) in the Pathologenesis of Myeloproliferative Disorders. JKAU: Med. Sci. 16(1).
[4] Xiaoyi Hu, Jing Li, Maorong Fu, Xia Zhao, Wei Wang. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Signal Transduct Target Ther. 2021 Nov 26;6(1):402.
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