伊文思藍(lán)在近紅外三區(qū)窗口激發(fā)下用于小鼠腦血管三光子熒光成像

重要研究者包括SHEN TONG, HONGJI LIU, JIE HUANG, JINCHENG ZHONG, JIEMEI YAN, HENG WANG, XIAO ZHANG, PING QIU, KE WANG，成果以《In vivo three-photon fluorescence imaging of mouse brain vasculature labeled by Evans blue excited at the NIR-III window》為題，2025年1月發(fā)表于《Biomedical Optics Express》。

重要發(fā)現(xiàn)
01伊文思藍(lán)的光學(xué)特性突破
1.三光子作用截面（ησ₃）的顯著優(yōu)勢(shì)
實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比磺基羅丹明101（SR101）參考試樣，量化了伊文思藍(lán)在NIR-III窗口的三光子效率。

結(jié)果顯示：
在血漿環(huán)境中，伊文思藍(lán)的ησ₃值高達(dá)520×10⁻⁸⁴cm⁶s²/photon²（1720nm激發(fā)），比SR101的參比值（65.5×10⁻⁸⁴cm⁶s²/photon²）提升近8倍。
水溶液中幾乎無3PF信號(hào)（平均計(jì)數(shù)18），而血漿中信號(hào)強(qiáng)度達(dá)3126計(jì)數(shù)，證實(shí)其依賴血漿蛋白結(jié)合的特性。

2.波長依賴性與非線性驗(yàn)證
通過1600–1840nm波長掃描，證實(shí)熒光信號(hào)與激發(fā)功率呈三次方關(guān)系（斜率≈3）。
符合三光子過程特征：
1600nm激發(fā)斜率：3.11
1720nm激發(fā)斜率：3.01
1800nm激發(fā)斜率：2.97

2.代謝穩(wěn)定性
注射1小時(shí)后，血管內(nèi)3PF信號(hào)強(qiáng)度保持穩(wěn)定，印證其"不易代謝"特性，適合長時(shí)程成像。

03穿透深度與分辨率突破
使用1720nm激發(fā)光源和高數(shù)值孔徑物鏡，實(shí)現(xiàn)：
1550μm深度成像：跨越灰質(zhì)（300–900μm）、白質(zhì)（950–1150μm）至海馬區(qū)。
高對(duì)比度：信背比（SBR）從300μm處的500:1降至1550μm處的5:1，海馬區(qū)仍達(dá)13:1。
微血管分辨：40μm深度血管直徑精確測(cè)量為2.2μm，驗(yàn)證亞細(xì)胞級(jí)分辨率。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破深腦成像技術(shù)瓶頸
1.首探NIR-III窗口染料適用性
首次將伊文思藍(lán)——傳統(tǒng)用于血腦屏障評(píng)估的低毒染料——拓展至NIR-III窗口三光子成像，填補(bǔ)該波段小分子探針的空白。

2.三重穿透增強(qiáng)策略
結(jié)合長波長激發(fā)（1720nm）、三階非線性效應(yīng)和高ησ₃探針，穿透深度較傳統(tǒng)雙光子（2PF）提升近2倍，突破白質(zhì)散射屏障。

2.多尺度結(jié)構(gòu)解析
從皮層微血管（2.2μm）至海馬大血管，單次成像覆蓋全腦血管層級(jí)，助力腦疾病血管機(jī)制研究。

2.為深部探針設(shè)計(jì)提供范式
證實(shí)"血漿環(huán)境增強(qiáng)熒光"機(jī)制，為開發(fā)類似探針（如蛋白結(jié)合型染料）指明方向。

總結(jié)與展望
本研究首次證實(shí)伊文思藍(lán)在NIR-III窗口激發(fā)下具備優(yōu)異的三光子熒光特性，其高ησ₃值（520×10⁻⁸⁴cm⁶s²/photon²）、體內(nèi)外光譜一致性及代謝穩(wěn)定性，成功支撐了1550μm深度的活體腦血管成像，穿透全腦灰質(zhì)、白質(zhì)并抵達(dá)海馬區(qū)。這一突破不僅為深部腦研究提供了安全、低成本的熒光標(biāo)記工具，更開創(chuàng)了傳統(tǒng)染料在新型光學(xué)窗口的應(yīng)用先河。

未來工作可聚焦三方面：
動(dòng)力學(xué)拓展：結(jié)合血流速度測(cè)量技術(shù)，研究腦血管功能與病理變化；
多模態(tài)集成：融合THG（第三諧波）等無標(biāo)記成像，同步解析血管與神經(jīng)結(jié)構(gòu)；
疾病模型應(yīng)用：針對(duì)中風(fēng)、阿爾茨海默癥等模型，探索血管通透性與病變關(guān)聯(lián)。

伊文思藍(lán)的深腦成像能力，有望成為揭開腦疾病機(jī)制的關(guān)鍵"光學(xué)探針"，推動(dòng)神經(jīng)科學(xué)研究進(jìn)入更深維度。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Tong S, Liu H, Huang J, Zhong J, Yan J, Wang H, Zhang X, Qiu P, Wang K. In vivo three-photon fluorescence imaging of mouse brain vasculature labeled by Evans blue excited at the NIR-III window. Biomed Opt Express. 2024 Dec 20;16(1):257-266. 
DOI:10.1364/BOE.545987.