基于C-CRISPR優(yōu)化的跨物種囊胚互補(bǔ)實現(xiàn)小鼠體內(nèi)生成大鼠前腦組織
場景恐懼 | 吳軍/楊輝/周海波/郭帆團(tuán)隊在小鼠體內(nèi)生成大鼠前腦組織
論文上線截圖
這篇發(fā)表于《Cell》的研究報道了一種基于C-CRISPR優(yōu)化的跨物種囊胚互補(bǔ)（IBC）技術(shù)，實現(xiàn)了在小鼠體內(nèi)生成大鼠前腦組織。研究者通過快速篩選候選基因，發(fā)現(xiàn)Hesx1基因缺失的小鼠胚胎為大鼠胚胎干細(xì)胞（rESCs）提供了發(fā)育空位，成功重建了結(jié)構(gòu)和功能正常的異種大鼠前腦。該前腦組織在小鼠宿主體內(nèi)以小鼠的發(fā)育節(jié)奏生長，但保持了大鼠特異的轉(zhuǎn)錄組特征，顯示出細(xì)胞自主性和非細(xì)胞自主性機(jī)制共同調(diào)控的復(fù)雜發(fā)育過程。功能評估包括神經(jīng)元電生理記錄和行為學(xué)測試，均表明重建的前腦具備正常神經(jīng)功能。研究還揭示了發(fā)育中期至晚期存在的異種細(xì)胞競爭和排斥障礙，提示未來需克服這些屏障以提高異種嵌合效率。該工作不僅首次實現(xiàn)了腦組織的跨物種囊胚互補(bǔ)，開辟了利用異種胚胎干細(xì)胞研究腦發(fā)育、認(rèn)知功能及進(jìn)化機(jī)制的新途徑，也為解決器官移植供體短缺提供了潛在技術(shù)平臺。
1.CCBC技術(shù)通過高效敲除Hesx1基因成功構(gòu)建前腦發(fā)育缺陷模型，并實現(xiàn)90%以上的前腦組織重建效率
作者首先系統(tǒng)性地展示了基于C-CRISPR的囊胚互補(bǔ)技術(shù)（CCBC）在器官再生研究中的應(yīng)用。如圖1A左所示，研究者將C-CRISPR技術(shù)與傳統(tǒng)囊胚互補(bǔ)技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出CCBC這一創(chuàng)新方法，該方法能快速篩選候選基因并一步生成基因敲除動物。在概念驗證階段（圖1A右），研究者針對7個Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選�；蚓庉嬓黍炞C顯示（圖1B），所有候選基因均可被高效敲除，其中Dkk1、Hesx1和Six3的敲除導(dǎo)致顯著的前腦發(fā)育缺陷（圖1C,D）。進(jìn)一步的嵌合體實驗證實（圖1E,F），在Dkk1−/−和Hesx1−/−胚胎中注射mESCs可成功重建完整異源前腦，其中Hesx1−/−嵌合體表現(xiàn)出97.06%的高效前腦重構(gòu)率（圖1H,I）；而Six3−/−胚胎則無法被供體細(xì)胞挽救（圖1E,F）。在新生嵌合體分析中（圖1G），Dkk1−/−+mESCs組獲得55只（90.16%）成功重建前腦的個體，進(jìn)一步證實了該技術(shù)的可靠性。這些結(jié)果不僅驗證了CCBC技術(shù)的高效性，更揭示了不同基因在前腦發(fā)育中的特異性作用，為復(fù)雜器官的再生研究提供了重要技術(shù)平臺和理論依據(jù)。
2. Hesx1敲除背景下小鼠前腦的種內(nèi)胚胎干細(xì)胞補(bǔ)償
接下來，作者通過將tdTomato+ mESCs注入Hesx1−/−（由CAG啟動子驅(qū)動EGFP表達(dá)）囊胚，成功構(gòu)建了EGFP-tdTomato雙標(biāo)記嵌合體（圖2A-B）。在Hesx1−/−+mESCs嵌合體中，前腦（大腦皮層和海馬區(qū)）幾乎全部（~100%）由供體來源的tdTomato+細(xì)胞構(gòu)成，顯著高于WT+mESCs嵌合體的~50%（圖2C-2E）；而中腦嵌合率仍維持在約50%（圖2E），表明Hesx1缺失導(dǎo)致的前腦生態(tài)位空缺可被供體細(xì)胞完全填補(bǔ)。所有嵌合小鼠均存活至成年，且腦部大小與對照組無差異（圖2F-2H）。以上結(jié)果證明Hesx1缺失可特異性實現(xiàn)小鼠前腦的高效供體細(xì)胞嵌合，為種內(nèi)前腦互補(bǔ)提供了概念驗證。
圖2.Hesx1−/−小鼠前腦的種內(nèi)囊胚互補(bǔ)
3.小鼠內(nèi)IBC介導(dǎo)的大鼠前腦構(gòu)建
其次，作者通過CCBC生成rESC衍生前腦組織（圖3A）。圖3B為WT+rESCs和Hesx1/+rESCs嵌合體在P3和20個月時的代表性圖像。在Hesx1−/−嵌合體中，大鼠來源的tdTomato+細(xì)胞在皮層和海馬區(qū)占比更高（圖3C-3E）。功能實驗證實，rESCs衍生的神經(jīng)元能形成完整的軸突投射通路：從前外側(cè)運(yùn)動皮層（ALM）投射至丘腦、上丘和延髓等靶區(qū)（圖3F），且投射纖維同時表達(dá)EGFP和tdTomato雙標(biāo)記信號（圖3G）。電生理實驗表明，嵌合體中的大鼠和小鼠皮層神經(jīng)元均能產(chǎn)生正常的動作電位（圖3H-3K），且兩者的輸入阻抗（圖3L）、靜息膜電位（圖3M）及閾值電流（圖3N）均無顯著差異。綜上，Hesx1−/− rESCs能高效生成前腦組織并整合到宿主神經(jīng)環(huán)路中，其衍生的神經(jīng)元具有正常的電生理特性和長距離投射能力。
圖3.通過IBC在小鼠中生成大鼠前腦組織
4. 跨物種嵌合體與同物種嵌合體中，重建的前腦均具備正常的結(jié)構(gòu)和功能
Hesx1−/−+rESCs嵌合體與WT+mESCs及Hesx1−/−+mESCs嵌合體的體重增長曲線相似（圖4A），且三組嵌合體的大腦皮層V區(qū)及海馬區(qū)均表達(dá)神經(jīng)標(biāo)記CTIP2，皮層厚度與細(xì)胞密度無顯著差異（圖4B–4E）。行為學(xué)測試（Morris水迷宮、曠場實驗及恐懼條件反射）進(jìn)一步表明，各組嵌合體的認(rèn)知功能均正常（圖4F–4H）。綜上，種間嵌合體重構(gòu)的前腦在結(jié)構(gòu)與功能上均發(fā)育正常。
圖4.種內(nèi)或種間嵌合體重構(gòu)的前腦在結(jié)構(gòu)和功能上均表現(xiàn)正常
5. 發(fā)育中晚期的異種屏障
在Hesx1−/−+rESCs嵌合體發(fā)育過程中，隨著胚胎生長，大鼠細(xì)胞在小鼠胎兒中的整體嵌合率從約60%逐漸下降至E17.5時的20%，而前腦區(qū)域的嵌合水平也從早期的90%-100%顯著降低至E15.5時的約60%（圖5A–5C）。這些數(shù)據(jù)表明，大鼠和小鼠之間存在妊娠中晚期的種間屏障，導(dǎo)致嵌合效率下降。以上結(jié)果表明異種嵌合體在發(fā)育中晚期面臨顯著的種間限制，需進(jìn)一步優(yōu)化方法以提高嵌合率。
圖5.Hesx1−/−+rESCs嵌合體中供體大鼠細(xì)胞的動態(tài)貢獻(xiàn)
6. 大鼠-小鼠嵌合前腦重構(gòu)中的細(xì)胞自主與非自主作用
Hesx1−/−+rESCs（大鼠-小鼠嵌合體）胚胎的腦發(fā)育速率與野生型小鼠及Hesx1−/−+mESCs（小鼠-小鼠嵌合體）一致（圖6A），表明嵌合體內(nèi)大鼠腦組織的發(fā)育與小鼠宿主同步。單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）分析（圖6B-6D）發(fā)現(xiàn)，rESC在嵌合前腦中分化為興奮性神經(jīng)元（EXs）、抑制性神經(jīng)元（INs）等多種細(xì)胞類型（圖6E），且其轉(zhuǎn)錄組特征與野生型大鼠神經(jīng)元相似，而宿主Hesx1−/−小鼠神經(jīng)元則保持小鼠特征（圖6F、6G）。差異基因分析（圖6H）顯示，部分基因在軸突發(fā)生、前腦發(fā)育等通路中富集（圖6I、6J）。以上結(jié)果表明嵌合體內(nèi)大鼠神經(jīng)元的發(fā)育和轉(zhuǎn)錄組特征主要由細(xì)胞自主性機(jī)制調(diào)控，同時受宿主微環(huán)境部分影響。
圖6.前腦重建型大鼠-小鼠嵌合體中的細(xì)胞自主性與非細(xì)胞自主性效應(yīng)
SA218 場景恐懼系統(tǒng)
場景恐懼實驗系統(tǒng)（FCS）用于小型嚙齒類動物（大、小鼠）環(huán)境相關(guān)條件性恐懼實驗研究。嚙齒類動物在恐懼時會表現(xiàn)出特有的不動狀態(tài)（immobility），動物在這種情況下傾向于保持靜止不動的防御姿勢�？挂钟羲幒涂怪袠信d奮藥可以明顯縮短不動狀態(tài)持續(xù)的時間。
實驗過程中，實驗對象被給與一個聲音信號（條件刺激），隨后給予電擊（非條件）刺激。該訓(xùn)練稱為條件性訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后實驗動物進(jìn)行聲音信號或環(huán)境聯(lián)系性實驗。一般情況下嚙齒類動物對相應(yīng)的環(huán)境和不同環(huán)境下同樣的聲音信號都會做出明顯的條件性恐懼反應(yīng)，如靜止不動。這種測試可以在訓(xùn)練結(jié)束后立刻或幾天后進(jìn)行可以提供在條件信號影響下短期和長期記憶的信息。
SA201 Morris水迷宮
Morris水迷宮（Morris water maze, MWM）實驗是一種強(qiáng)迫實驗動物（大鼠、小鼠）游泳，學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺的一種實驗，主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感（空間定位）的學(xué)習(xí)記憶能力。被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶、老年癡呆、海馬/外海馬研究、智力與衰老、新藥開發(fā)/篩選/評價、藥理學(xué)、毒理學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、動物心理學(xué)及行為生物學(xué)等多個學(xué)科的科學(xué)研究和計算機(jī)輔助教學(xué)等領(lǐng)域。
SA215 曠場視頻分析系統(tǒng)
曠場實驗視頻分析系統(tǒng)（open field test）是觀察研究實驗動物神經(jīng)精神變化、進(jìn)入開闊環(huán)境后的各種行為，例如動物對新開闊環(huán)境的恐懼而主要在周邊區(qū)域活動，在中央?yún)^(qū)域活動較少，但動物的探究特性又促使其產(chǎn)生在中央?yún)^(qū)域活動的動機(jī)，也可觀察由此而產(chǎn)生的焦慮心理。中樞興奮藥物可以明顯增加自主的活動而減少探究行為，一定劑量的抗精神病藥物可以減少探究行為而不影響自主活動。
論文上線截圖
這篇發(fā)表于《Cell》的研究報道了一種基于C-CRISPR優(yōu)化的跨物種囊胚互補(bǔ)（IBC）技術(shù)，實現(xiàn)了在小鼠體內(nèi)生成大鼠前腦組織。研究者通過快速篩選候選基因，發(fā)現(xiàn)Hesx1基因缺失的小鼠胚胎為大鼠胚胎干細(xì)胞（rESCs）提供了發(fā)育空位，成功重建了結(jié)構(gòu)和功能正常的異種大鼠前腦。該前腦組織在小鼠宿主體內(nèi)以小鼠的發(fā)育節(jié)奏生長，但保持了大鼠特異的轉(zhuǎn)錄組特征，顯示出細(xì)胞自主性和非細(xì)胞自主性機(jī)制共同調(diào)控的復(fù)雜發(fā)育過程。功能評估包括神經(jīng)元電生理記錄和行為學(xué)測試，均表明重建的前腦具備正常神經(jīng)功能。研究還揭示了發(fā)育中期至晚期存在的異種細(xì)胞競爭和排斥障礙，提示未來需克服這些屏障以提高異種嵌合效率。該工作不僅首次實現(xiàn)了腦組織的跨物種囊胚互補(bǔ)，開辟了利用異種胚胎干細(xì)胞研究腦發(fā)育、認(rèn)知功能及進(jìn)化機(jī)制的新途徑，也為解決器官移植供體短缺提供了潛在技術(shù)平臺。
1.CCBC技術(shù)通過高效敲除Hesx1基因成功構(gòu)建前腦發(fā)育缺陷模型，并實現(xiàn)90%以上的前腦組織重建效率
作者首先系統(tǒng)性地展示了基于C-CRISPR的囊胚互補(bǔ)技術(shù)（CCBC）在器官再生研究中的應(yīng)用。如圖1A左所示，研究者將C-CRISPR技術(shù)與傳統(tǒng)囊胚互補(bǔ)技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出CCBC這一創(chuàng)新方法，該方法能快速篩選候選基因并一步生成基因敲除動物。在概念驗證階段（圖1A右），研究者針對7個Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選�；蚓庉嬓黍炞C顯示（圖1B），所有候選基因均可被高效敲除，其中Dkk1、Hesx1和Six3的敲除導(dǎo)致顯著的前腦發(fā)育缺陷（圖1C,D）。進(jìn)一步的嵌合體實驗證實（圖1E,F），在Dkk1−/−和Hesx1−/−胚胎中注射mESCs可成功重建完整異源前腦，其中Hesx1−/−嵌合體表現(xiàn)出97.06%的高效前腦重構(gòu)率（圖1H,I）；而Six3−/−胚胎則無法被供體細(xì)胞挽救（圖1E,F）。在新生嵌合體分析中（圖1G），Dkk1−/−+mESCs組獲得55只（90.16%）成功重建前腦的個體，進(jìn)一步證實了該技術(shù)的可靠性。這些結(jié)果不僅驗證了CCBC技術(shù)的高效性，更揭示了不同基因在前腦發(fā)育中的特異性作用，為復(fù)雜器官的再生研究提供了重要技術(shù)平臺和理論依據(jù)。
圖1.CCBC技術(shù)為神經(jīng)囊胚互補(bǔ)提供了快速遺傳篩選方案
2. Hesx1敲除背景下小鼠前腦的種內(nèi)胚胎干細(xì)胞補(bǔ)償
接下來，作者通過將tdTomato+ mESCs注入Hesx1−/−（由CAG啟動子驅(qū)動EGFP表達(dá)）囊胚，成功構(gòu)建了EGFP-tdTomato雙標(biāo)記嵌合體（圖2A-B）。在Hesx1−/−+mESCs嵌合體中，前腦（大腦皮層和海馬區(qū)）幾乎全部（~100%）由供體來源的tdTomato+細(xì)胞構(gòu)成，顯著高于WT+mESCs嵌合體的~50%（圖2C-2E）；而中腦嵌合率仍維持在約50%（圖2E），表明Hesx1缺失導(dǎo)致的前腦生態(tài)位空缺可被供體細(xì)胞完全填補(bǔ)。所有嵌合小鼠均存活至成年，且腦部大小與對照組無差異（圖2F-2H）。以上結(jié)果證明Hesx1缺失可特異性實現(xiàn)小鼠前腦的高效供體細(xì)胞嵌合，為種內(nèi)前腦互補(bǔ)提供了概念驗證。
圖2.Hesx1−/−小鼠前腦的種內(nèi)囊胚互補(bǔ)
3.小鼠內(nèi)IBC介導(dǎo)的大鼠前腦構(gòu)建
其次，作者通過CCBC生成rESC衍生前腦組織（圖3A）。圖3B為WT+rESCs和Hesx1/+rESCs嵌合體在P3和20個月時的代表性圖像。在Hesx1−/−嵌合體中，大鼠來源的tdTomato+細(xì)胞在皮層和海馬區(qū)占比更高（圖3C-3E）。功能實驗證實，rESCs衍生的神經(jīng)元能形成完整的軸突投射通路：從前外側(cè)運(yùn)動皮層（ALM）投射至丘腦、上丘和延髓等靶區(qū)（圖3F），且投射纖維同時表達(dá)EGFP和tdTomato雙標(biāo)記信號（圖3G）。電生理實驗表明，嵌合體中的大鼠和小鼠皮層神經(jīng)元均能產(chǎn)生正常的動作電位（圖3H-3K），且兩者的輸入阻抗（圖3L）、靜息膜電位（圖3M）及閾值電流（圖3N）均無顯著差異。綜上，Hesx1−/− rESCs能高效生成前腦組織并整合到宿主神經(jīng)環(huán)路中，其衍生的神經(jīng)元具有正常的電生理特性和長距離投射能力。
圖3.通過IBC在小鼠中生成大鼠前腦組織
4. 跨物種嵌合體與同物種嵌合體中，重建的前腦均具備正常的結(jié)構(gòu)和功能
Hesx1−/−+rESCs嵌合體與WT+mESCs及Hesx1−/−+mESCs嵌合體的體重增長曲線相似（圖4A），且三組嵌合體的大腦皮層V區(qū)及海馬區(qū)均表達(dá)神經(jīng)標(biāo)記CTIP2，皮層厚度與細(xì)胞密度無顯著差異（圖4B–4E）。行為學(xué)測試（Morris水迷宮、曠場實驗及恐懼條件反射）進(jìn)一步表明，各組嵌合體的認(rèn)知功能均正常（圖4F–4H）。綜上，種間嵌合體重構(gòu)的前腦在結(jié)構(gòu)與功能上均發(fā)育正常。
圖4.種內(nèi)或種間嵌合體重構(gòu)的前腦在結(jié)構(gòu)和功能上均表現(xiàn)正常
5. 發(fā)育中晚期的異種屏障
在Hesx1−/−+rESCs嵌合體發(fā)育過程中，隨著胚胎生長，大鼠細(xì)胞在小鼠胎兒中的整體嵌合率從約60%逐漸下降至E17.5時的20%，而前腦區(qū)域的嵌合水平也從早期的90%-100%顯著降低至E15.5時的約60%（圖5A–5C）。這些數(shù)據(jù)表明，大鼠和小鼠之間存在妊娠中晚期的種間屏障，導(dǎo)致嵌合效率下降。以上結(jié)果表明異種嵌合體在發(fā)育中晚期面臨顯著的種間限制，需進(jìn)一步優(yōu)化方法以提高嵌合率。
圖5.Hesx1−/−+rESCs嵌合體中供體大鼠細(xì)胞的動態(tài)貢獻(xiàn)
6. 大鼠-小鼠嵌合前腦重構(gòu)中的細(xì)胞自主與非自主作用
Hesx1−/−+rESCs（大鼠-小鼠嵌合體）胚胎的腦發(fā)育速率與野生型小鼠及Hesx1−/−+mESCs（小鼠-小鼠嵌合體）一致（圖6A），表明嵌合體內(nèi)大鼠腦組織的發(fā)育與小鼠宿主同步。單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）分析（圖6B-6D）發(fā)現(xiàn)，rESC在嵌合前腦中分化為興奮性神經(jīng)元（EXs）、抑制性神經(jīng)元（INs）等多種細(xì)胞類型（圖6E），且其轉(zhuǎn)錄組特征與野生型大鼠神經(jīng)元相似，而宿主Hesx1−/−小鼠神經(jīng)元則保持小鼠特征（圖6F、6G）。差異基因分析（圖6H）顯示，部分基因在軸突發(fā)生、前腦發(fā)育等通路中富集（圖6I、6J）。以上結(jié)果表明嵌合體內(nèi)大鼠神經(jīng)元的發(fā)育和轉(zhuǎn)錄組特征主要由細(xì)胞自主性機(jī)制調(diào)控，同時受宿主微環(huán)境部分影響。
圖6.前腦重建型大鼠-小鼠嵌合體中的細(xì)胞自主性與非細(xì)胞自主性效應(yīng)
SA218 場景恐懼系統(tǒng)
實驗過程中，實驗對象被給與一個聲音信號（條件刺激），隨后給予電擊（非條件）刺激。該訓(xùn)練稱為條件性訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后實驗動物進(jìn)行聲音信號或環(huán)境聯(lián)系性實驗。一般情況下嚙齒類動物對相應(yīng)的環(huán)境和不同環(huán)境下同樣的聲音信號都會做出明顯的條件性恐懼反應(yīng)，如靜止不動。這種測試可以在訓(xùn)練結(jié)束后立刻或幾天后進(jìn)行可以提供在條件信號影響下短期和長期記憶的信息。
SA201 Morris水迷宮
Morris水迷宮（Morris water maze, MWM）實驗是一種強(qiáng)迫實驗動物（大鼠、小鼠）游泳，學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺的一種實驗，主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感（空間定位）的學(xué)習(xí)記憶能力。被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶、老年癡呆、海馬/外海馬研究、智力與衰老、新藥開發(fā)/篩選/評價、藥理學(xué)、毒理學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、動物心理學(xué)及行為生物學(xué)等多個學(xué)科的科學(xué)研究和計算機(jī)輔助教學(xué)等領(lǐng)域。
SA215 曠場視頻分析系統(tǒng)
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場景恐懼系統(tǒng)
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