多元 PCR引物設(shè)計(jì)技能詳解

多元 PCR (多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一個(gè) PCR 反應(yīng)中使用一個(gè)模板和幾對引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段的 PCR 反應(yīng)。這項(xiàng)技術(shù)非常有用，他不僅可以提高 PCR 的產(chǎn)率還能提高 DNA 樣品的利用率。

另一種形式的 MPCR 是組合 PCR, 組合 PCR 是在同一 PCR 反應(yīng)中使用幾個(gè)不同的模板和幾對引物。多元 PCR 和組合 PCR 往往被當(dāng)作同義詞使用。

MPCR 要求所有的引物對在同一條件下擴(kuò)增其各自的特異序列。大多數(shù)多元 PCR 反應(yīng) 局限于擴(kuò)增 5~10 個(gè)目的片段，原因之一是反應(yīng)中，每另加入一對引物會導(dǎo)致一定程度的靈活性的丟失。引物數(shù)量的增加也使引物二聚體和非特異擴(kuò)增出現(xiàn)的概率增加。因此，進(jìn)行多元 PCR 要求周密計(jì)劃，且需多次嘗試，使反應(yīng)條件優(yōu)化。

理論上，一個(gè)多元反應(yīng)中，所有引物擴(kuò)增其特異序列的效率應(yīng)該是一樣的，但通常是很難預(yù)測一對引物的效率。在相似條件下，退火溫度幾乎相同的寡核苷酸可更好地工作。

多元 PCR 引物設(shè)計(jì)和優(yōu)化的一般規(guī)律：

當(dāng)設(shè)計(jì) MPCR 引物時(shí)，除了引物設(shè)計(jì)的一般規(guī)律外，其他一些因素也必須考慮。一般 來說，一個(gè)多元反應(yīng)中使用的所有引物的 Tm 值應(yīng)該接近，要避免 3'-核苷酸互補(bǔ)，每一對引物應(yīng)獨(dú)立地優(yōu)化其反應(yīng)條件。一旦將引物集中，需按順序混合，然后再進(jìn)行優(yōu)化。

1. 引物長度應(yīng)為 18~24 個(gè)堿基，較長的引物更容易形成引物二聚體。
2. 對于 MPCR，退火溫度和循環(huán)數(shù)非常關(guān)鍵。要盡可能提髙退火溫度，要確認(rèn)每一對 引物單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)的退火溫度，然后在多元 PCR 反應(yīng)時(shí)采用最低的退火溫度。同樣，要采用最少的擴(kuò)增數(shù)。
3. 由于多個(gè)模板同時(shí)擴(kuò)增，酶量和核苷酸濃度可能成為限制因子，而且完全合成所有 產(chǎn)物所需的時(shí)間增加。因此，優(yōu)化每個(gè)反應(yīng)的試劑濃度和延伸時(shí)間就顯得非常重要。相對于 單個(gè)目的序列的 PCR 而言，多元 PCR 所需延伸時(shí)間較長。