高通量雙光子成像技術兆赫級掃描大腦神經元活動

理解大腦如何工作，需要我們能夠窺視其內部密集的神經元網絡，觀察它們是如何被激活并相互“交流”的。在活體大腦中，同時、快速、清晰地對成千上萬個神經元的活動進行成像，是神經科學領域長期追求的目標。近日，一項發(fā)表于頂級期刊的研究介紹了一種名為FACED 2.0的革命性成像技術，它猶如為觀察大腦內部世界安裝了一臺“超高速、超高清攝像機”，首次實現(xiàn)了在活體動物中同時對數百個神經元的電壓信號和上萬個神經元的鈣信號進行大規(guī)模記錄，將神經活動成像的尺度、速度和分辨率推向了前所未有的新高度。

這項突破性研究由Jian Zhong、Ryan G. Natan、Qinrong Zhang、Justin S. J. Wong、Christoph Miehl、Krishnashish Bose、Xiaoyu Lu、Francois St-Pierre、Su Guo、Brent Doiron、Kevin K. Tsia和Na Ji共同完成。他們的研究成果以題為“FACED 2.0 enables large-scale voltage and calcium imaging in vivo”的論文形式在線發(fā)表在《自然-方法》（Nature Methods）期刊上。

重要發(fā)現(xiàn)
01重新定義高速成像的邊界
本論文的核心在于對FACED（自由空間角度啁啾增強延遲）成像技術進行了全面升級，推出了FACED 2.0系統(tǒng)。傳統(tǒng)雙光子熒光顯微鏡的成像速度受限于機械式掃描鏡的慣性，其線掃描率通常僅為每秒數萬次，導致成像幀率有限。FACED技術的精髓在于，它采用了一種全光學的、被動的掃描模塊，通過一對近乎平行的反射鏡將單個激光脈沖“復制”成在空間上分離、時間上延遲的一系列焦點陣列。這個陣列本身就構成了一次線掃描，其掃描速率直接等于激光的重復頻率，可輕松達到兆赫級別，是傳統(tǒng)方法的數十倍。

FACED 2.0在此基礎上，通過硬件和軟件的協(xié)同優(yōu)化，實現(xiàn)了在超大視野和三維體積內，以亞細胞分辨率進行連續(xù)、超快的成像。其像素率高達每秒10億像素，同時保持了與傳統(tǒng)方法相媲美的空間分辨率和成像深度。

為了獲得二維圖像，系統(tǒng)使用一個標準的振鏡掃描鏡沿垂直于這條“光針”線的方向進行慢速掃描，從而完成逐行掃描。為了進一步擴大成像視野，F(xiàn)ACED 2.0引入了第二個振鏡，用于橫向拼接多個高速的FACED視野。例如，通過拼接八個視野，可以在0.8數值孔徑的物鏡下，以每幀5.3毫秒的速度采集超過1.1毫米 x 1.0毫米的超大范圍。為了實現(xiàn)高速三維體成像，系統(tǒng)通過一個快速壓電平臺軸向振蕩物鏡，由于FACED 2.0的毫秒級幀采集時間，連續(xù)的軸向移動不會產生幀內運動偽影。

重要的是FACED 2.0在追求速度的同時并未犧牲分辨率。在整個拼接視野內，它對200納米熒光珠成像的橫向分辨率在半高全寬尺度上優(yōu)于1.3微米，軸向分辨率優(yōu)于5微米。這足以在三維空間內分辨尺寸小至10微米的神經元胞體，為準確測量單個神經元的活動奠定了基礎。

隨后，研究展示了FACED 2.0在大規(guī)模電壓成像上的里程碑式能力。利用表達基因編碼電壓指示劑JEDI-2P-Kv的小鼠，他們同時記錄了視覺皮層182個第2/3層神經元的電壓活動，幀率高達每秒800幀。這不僅捕捉到神經元放電的尖峰信號，還首次在如此大規(guī)模的群體中，同步記錄到了與輸入信息相關的閾下膜電位波動。數據分析揭示了神經元群體輸入與輸出活動關聯(lián)性的新特征，并測量了數百個神經元將膜電位轉化為放電頻率的輸入-輸出函數冪律指數。

最后，FACED 2.0在高通量三維鈣成像方面的威力得到了充分展現(xiàn)。在清醒的轉基因小鼠視覺皮層，研究人員對一個1.1毫米 x 1.0毫米 x 0.4毫米的體積進行成像，以每體積259.7毫秒的速度，從該體積內手動分割了13,962個神經元，并基于其活動識別出12,511個獨立神經元，其中超過九千個表現(xiàn)出視覺誘發(fā)的方向選擇性反應。此外，在野生型小鼠中，成像深度可達皮層下約750微米，同時記錄了跨越整個皮層深度的14,005個神經元的鈣活動。對于斑馬魚幼魚這類小腦模型，F(xiàn)ACED 2.0能夠以每體積96毫秒的速度對其全腦進行快速三維鈣成像，識別出自發(fā)活動的神經元集群。

創(chuàng)新與亮點
解決“速度-分辨率-范圍”不可能三角。
傳統(tǒng)高速成像技術往往需要在成像速度、空間分辨率（尤其是軸向分辨率）和成像范圍之間做出妥協(xié)。FACED 2.0的核心創(chuàng)新在于，它采用高數值孔徑的聚焦光點，以兆赫茲的線掃描速率順序掃描樣品，并通過非成像探測器收集熒光。這種設計使其保持了傳統(tǒng)雙光子顯微鏡的光學層切能力和深層成像優(yōu)勢，同時在實現(xiàn)高速成像時完全不犧牲軸向分辨率。與其他高通量熒光成像方法相比，F(xiàn)ACED 2.0在高吞吐量、高時空分辨率和大的成像深度三者之間取得了最佳平衡。

實現(xiàn)大規(guī)模神經元電壓活動直接觀測。
電壓成像直接反映神經元的膜電位變化，是研究神經信息處理的“金標準”，但因其信號微弱、對速度要求極高，長期以來難以進行大規(guī)模群體記錄。FACED 2.0憑借其極高的成像速度和信噪比，首次利用雙光子激發(fā)實現(xiàn)了對超過200個神經元的群體電壓成像，并能同時解析其閾下和閾上活動。這為在系統(tǒng)水平上研究神經環(huán)路的輸入-輸出轉換、相關性機制等基本問題打開了全新的窗口。

“暗態(tài)弛豫”帶來更高的光子效率。
大多數雙光子顯微鏡系統(tǒng)使用約80 MHz重復頻率的激光，這意味著每個像素在每幀內會受到多個激光脈沖的激發(fā)。而在FACED 2.0中，每幀內每個像素僅被一個激光脈沖激發(fā)。在每秒1000幀的速率下，后續(xù)的激發(fā)脈沖要間隔1毫秒才會再次到達同一樣品位置。這為熒光分子從其易于受損的暗態(tài)恢復到基態(tài)提供了充足的時間，即“暗態(tài)弛豫”效應。該效應已被證明能將雙光子成像的光子產量提高數個數量級。因此，F(xiàn)ACED 2.0能夠以與傳統(tǒng)方法相似的激發(fā)功率，在更高的幀率下成像，同時保持良好的信噪比。

總結與展望
FACED 2.0通過其獨特的全光學兆赫線掃描設計，成功突破了傳統(tǒng)雙光子顯微鏡在速度、規(guī)模和分辨率方面的限制，為神經科學和生物醫(yī)學研究提供了一款強大的體內成像工具。它不僅在技術層面實現(xiàn)了對數百神經元電壓活動和數萬神經元鈣活動的同時記錄，更在科學層面帶來了關于神經元群體編碼與轉換規(guī)律的新發(fā)現(xiàn)。

展望未來，隨著更明亮、更靈敏的熒光指示劑的不斷開發(fā)，F(xiàn)ACED 2.0的成像能力有望進一步提升，覆蓋更廣闊的腦區(qū)或更多的神經元。同時，改進系統(tǒng)的機械穩(wěn)定性、激光性能和光束穩(wěn)定技術，將使其操作更加簡便，更適合長期、穩(wěn)定的實驗需求。這項技術標志著高速高分辨活體成像進入了一個新紀元，將繼續(xù)推動我們在探索大腦奧秘和生命動態(tài)過程的道路上不斷前進。

doi: 10.1038/s41592-025-02925-7.