UA-Glo®熒光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒的技術(shù)原理、優(yōu)勢(shì)與操作流程

一、引言
細(xì)胞活力檢測(cè)是細(xì)胞生物學(xué)、藥物研發(fā)和毒性評(píng)價(jià)中的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)手段。評(píng)估細(xì)胞活力有助于理解細(xì)胞生理狀態(tài)、化合物效應(yīng)及環(huán)境因素的影響。熒光法細(xì)胞活力檢測(cè)基于活細(xì)胞中特異性蛋白酶活性，為研究人員提供了一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便且適用于多重分析的檢測(cè)工具。UA-Glo® 熒光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒采用該原理，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活力的快速定量，并與其他發(fā)光法檢測(cè)試劑兼容，適用于機(jī)制研究和內(nèi)參校正。本文系統(tǒng)闡述該試劑盒的技術(shù)原理、核心組分、操作流程、性能特點(diǎn)及應(yīng)用價(jià)值。

二、檢測(cè)原理
UA-Glo® 熒光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒基于活細(xì)胞中特異性蛋白酶的活性進(jìn)行檢測(cè)。其核心原理是：只有細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞內(nèi)才存在一種具有活性的特異性蛋白酶（如酯酶），該酶能夠切割特定的多肽-熒光基團(tuán)底物，釋放出熒光基團(tuán)，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。當(dāng)細(xì)胞膜完整性受損時(shí)，該蛋白酶迅速失去活性或從細(xì)胞內(nèi)泄漏，無法產(chǎn)生熒光信號(hào)。

因此，檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度與樣品中活細(xì)胞的數(shù)量直接相關(guān)。該方法檢測(cè)的是細(xì)胞膜完整性這一細(xì)胞活力的關(guān)鍵指標(biāo)，能夠反映早期輕微的細(xì)胞損傷，其檢測(cè)窗口早于ATP水平下降等晚期事件。

三、試劑盒核心組分與儲(chǔ)存
該試劑盒包含以下核心組分：
CTF底物：即特異性多肽-熒光基團(tuán)偶聯(lián)物，為100×濃縮液，需避光保存。
CTF緩沖液：用于稀釋底物和提供最適反應(yīng)條件。

試劑盒以不同規(guī)格提供，滿足96孔或384孔培養(yǎng)板的檢測(cè)需求。所有組分應(yīng)儲(chǔ)存于-20℃及以下，有效期12個(gè)月。初次使用后，建議將底物分裝保存，避免反復(fù)凍融，每次實(shí)驗(yàn)新鮮配制反應(yīng)液。

四、操作流程
該試劑盒操作流程簡(jiǎn)便快捷，主要包括以下步驟：

（一）細(xì)胞準(zhǔn)備
在96孔或384孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪種合適密度的待檢測(cè)細(xì)胞，建議使用黑框透明底細(xì)胞培養(yǎng)板以便于觀察和檢測(cè)。加入待檢測(cè)化合物進(jìn)行處理，注意培養(yǎng)液中有機(jī)溶劑濃度保持在1%以下。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。

（二）試劑準(zhǔn)備
取出試劑盒組分，將CTF緩沖液完全溶解并平衡至室溫。渦旋振蕩CTF底物使其徹底混勻，瞬時(shí)離心收集至管底。根據(jù)用量，用CTF緩沖液將100×的CTF底物稀釋成1×的CTF反應(yīng)液，充分混勻備用。

（三）加樣與反應(yīng)
取出待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入等體積的1× CTF反應(yīng)液。例如，若培養(yǎng)液體積為100μl，則加入100μl反應(yīng)液。低速振板20秒混勻，避光37℃孵育進(jìn)行反應(yīng)。

（四）熒光檢測(cè)
孵育適當(dāng)時(shí)間后，使用熒光讀板儀讀取熒光信號(hào)。最佳激發(fā)波長(zhǎng)為380-400nm，發(fā)射波長(zhǎng)為505nm。不同細(xì)胞對(duì)底物的切割速度不同，因此最佳讀板時(shí)間需根據(jù)具體細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化。最快可在加入試劑后30分鐘檢測(cè)，但通常孵育60分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間可獲得更高的信噪比。建議最長(zhǎng)孵育時(shí)間不超過3小時(shí)。

（五）多重分析
完成熒光細(xì)胞活力檢測(cè)后，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)繼續(xù)進(jìn)行下游的多重分析，如使用Caspase 3/7細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒或發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒對(duì)同一樣品進(jìn)行序貫檢測(cè)，以深入探究細(xì)胞毒性的機(jī)制。

五、性能特點(diǎn)
UA-Glo® 熒光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒具備以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
檢測(cè)早期損傷：該試劑盒檢測(cè)的是細(xì)胞膜完整性這一早期指標(biāo)，能夠反映比ATP水平下降更輕微的細(xì)胞損害，適用于需要監(jiān)測(cè)早期毒性效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

操作簡(jiǎn)便：采用“加樣-孵育-檢測(cè)”的均相操作模式，無需洗滌或轉(zhuǎn)移步驟，減少了操作誤差，適用于高通量篩選。

兼容性好：該試劑盒與本公司的發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒以及Caspase 3/7細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒兼容，可對(duì)同一樣品進(jìn)行序貫多重檢測(cè)，便于進(jìn)行機(jī)制研究和設(shè)立內(nèi)參對(duì)照。

靈敏度高：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，該試劑盒的檢測(cè)靈敏度與國外同類品牌產(chǎn)品相當(dāng)。在Hela細(xì)胞和HEK293細(xì)胞模型中均能獲得良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系和細(xì)胞計(jì)數(shù)線性。

結(jié)果可靠：與國外同類品牌產(chǎn)品的對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯示，兩種試劑盒在熒光細(xì)胞活力檢測(cè)中獲得的結(jié)果高度一致。在進(jìn)行序貫的發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)時(shí)，所計(jì)算出的藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）非常接近，證實(shí)了其結(jié)果的可靠性。

適用性廣泛：適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，適用于96孔和384孔培養(yǎng)板規(guī)格。

六、總結(jié)
UA-Glo® 熒光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒基于活細(xì)胞特異性蛋白酶活性原理，為細(xì)胞活力檢測(cè)提供了靈敏、簡(jiǎn)便、適用于多重分析的標(biāo)準(zhǔn)化工具。其在早期毒性檢測(cè)方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，以及與凋亡、發(fā)光法活力檢測(cè)試劑盒的兼容性，使其在藥物篩選、機(jī)制研究和基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

UA-Glo® 熒光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒技術(shù)原理與應(yīng)用-南京優(yōu)愛(UA BIO), 重組蛋白專家