文章分享：In vivo CAR-T中Ab-LNP抗體靶點的比較和選擇

本文來源于微信公眾： RNA星球   作者： 倍增的耀菌君

文獻題目：Rapid receptor internalization potentiates CD7-targeted lipid nanoparticles for efficient mRNA delivery to T cells and in vivo CAR T-cell engineering
發(fā)表期刊：bioRxiv（預印本）
發(fā)表時間：2025年1月26日
研究團隊：美國賓夕法尼亞大學/Capstan創(chuàng)始人Hamideh Parhiz為通訊作者
主要研究結果：本研究通過系統(tǒng)比較靶向不同T細胞表面受體（CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD4/8）的抗體功能化脂質納米顆粒（tLNP），發(fā)現(xiàn)靶向CD7的tLNP在將mRNA遞送至T細胞、進而于體內(nèi)外高效生成功能性嵌合抗原受體（CAR）T細胞方面表現(xiàn)最優(yōu)。其核心機制在于，決定tLNP遞送效率的關鍵因素是抗體-受體復合物的內(nèi)化能力，而非受體在細胞表面的豐度。這一內(nèi)化能力是每種受體固有的特性，為理性選擇最佳靶點以實現(xiàn)高效的體內(nèi)CAR-T細胞工程提供了全新框架。

研究背景
利用mRNA-LNP技術在體內(nèi)直接生成CAR-T細胞，可規(guī)避體外制造流程，實現(xiàn)瞬時、可控的CAR表達，從而簡化工藝并降低長期毒性。

然而，T細胞本身內(nèi)吞活性弱，難以有效攝取傳統(tǒng)LNP。靶向脂質納米顆粒（tLNP）通過表面偶聯(lián)識別T細胞受體的抗體，可引導LNP與特定T細胞亞群結合并觸發(fā)受體介導的內(nèi)吞，是實現(xiàn)體內(nèi)T細胞高效轉染的關鍵。盡管已有研究靶向CD4、CD5、CD8等不同受體，但何種靶點最優(yōu)、其效率差異背后的機制何在，尚不明確。解決這一問題，對于設計最優(yōu)的tLNP平臺至關重要。

核心內(nèi)容詳解

一、靶點頭對頭比較：CD7脫穎而出
研究對象與方法：
研究首先在完全相同的實驗條件下，系統(tǒng)比較了靶向CD2、CD4、CD5、CD7、CD8及CD4/8雙靶點的tLNPs。將編碼ZsGreen熒光報告蛋白的mRNA封裝入tLNP，用以定量評估遞送效率。用不同劑量的各種tLNP處理活化的人原代T細胞，24小時后通過流式細胞術分析ZsGreen陽性細胞比例和平均熒光強度（MFI）。

研究結果：

• 轉染效率：在最高劑量（1 μg mRNA/10萬細胞）下，靶向CD2、CD5和CD7的tLNPs均能高效轉染約80%的T細胞。而靶向CD4、CD4/8的tLNPs效率中等（~60%），靶向CD8的tLNP效率最低（僅17%）。
• 亞群特異性與廣度：CD2、CD5、CD7-tLNPs能同等高效地轉染CD4+和CD8+ T細胞。CD4-tLNP特異性轉染CD4+細胞，CD8-tLNP特異性轉染CD8+細胞，雙靶向tLNP雖能轉染兩者但效率較低。
• 蛋白表達強度：在高效轉染的tLNPs中，CD7-tLNP誘導的ZsGreen蛋白表達水平（MFI）最高，在CD4+和CD8+ T細胞中分別達25,583和23,131 A.U.，顯著高于CD5-tLNP和CD2-tLNP。

實驗小結：在測試的所有靶點中，靶向CD7的tLNP綜合性能最佳，兼具高轉染效率、廣譜的T細胞亞群覆蓋以及最強的蛋白表達輸出。

二、機制探索：效率的關鍵在于“內(nèi)化”，而非“數(shù)量”
研究對象與方法：
為闡明上述效率差異的根源，研究者檢驗了兩個假說：
1）受體豐度決定效率；
2）抗體-受體復合物的內(nèi)化能力決定效率。他們通過公共數(shù)據(jù)庫和流式細胞術分析了各受體在T細胞上的mRNA和蛋白表達水平。
同時，利用IncuCyte FabFluor-pH抗體標記系統(tǒng)（該標記在酸性溶酶體環(huán)境中熒光增強）和活細胞成像，定量比較了不同抗體-受體復合物的內(nèi)化動力學。此外，還將Cy5標記的mRNA封裝入tLNP，通過共聚焦顯微鏡直接觀察細胞內(nèi)mRNA的積累。

研究結果：

• 受體豐度并非決定因素：無論是轉錄組還是蛋白水平，CD2都是所測受體中表達量最高的，約為CD7的2-5倍。然而，CD2-tLNP產(chǎn)生的蛋白表達水平卻遠低于CD7-tLNP，表明豐度無法解釋效率差異。
• 內(nèi)化能力與遞送效率強相關：活細胞成像顯示，CD7抗體的內(nèi)化速度最快、程度最高，其次是CD5抗體，而CD2抗體內(nèi)化很弱。這種內(nèi)化差異在多個不同克隆的CD7和CD2抗體間均穩(wěn)定存在，表明這是受體固有的特性。
• 內(nèi)化直接驅動mRNA攝�。汗簿劢钩上耧@示，CD7-tLNP處理的細胞中，Cy5-mRNA的細胞內(nèi)積累最多，順序與抗體內(nèi)化能力完全一致（CD7 > CD5 > CD2）。定量分析證實，抗體內(nèi)化水平與細胞內(nèi)mRNA積累量呈極強正相關（r=0.894）。
• 翻譯狀態(tài)的潛在影響：細胞內(nèi)mRNA積累量與最終蛋白產(chǎn)量的相關性較弱（r=0.374）。RNA測序分析提示，CD7-tLNP處理的T細胞中，與mRNA代謝、翻譯和核糖體生物合成相關的通路更為活躍，表明靶向不同受體可能對細胞的翻譯活性有差異化調節(jié)。

實驗小結：本研究揭示了tLNP遞送效率的一個全新核心原則：抗體-受體復合物的內(nèi)化能力是決定mRNA遞送效率的關鍵，且該能力是受體的固有屬性。 這解釋了為何表達量并非最高的CD7能成為最佳靶點。

三、復雜環(huán)境與體內(nèi)驗證：CD7-tLNP表現(xiàn)穩(wěn)健
研究對象與方法：為了模擬體內(nèi)更真實的細胞競爭環(huán)境，研究在人外周血單個核細胞（PBMCs） 中評估了各tLNP的性能。隨后，在人源化小鼠模型（PBMC-NSG） 中，通過靜脈注射CD7-tLNP-ZsGreen，評估其體內(nèi)靶向遞送效率。

研究結果：

• 在PBMCs中：即使在與其他免疫細胞（如高內(nèi)吞活性的單核細胞）競爭的情況下，CD7-tLNP依然在CD4+和CD8+ T細胞中保持了最高的轉染效率。值得注意的是，CD7在NK細胞上也有高表達，因此CD7-tLNP還能有效轉染約30%的NK細胞，這為同時工程化CAR-T和CAR-NK細胞提供了可能。
• 在體內(nèi)：給人源化小鼠注射CD7-tLNP-ZsGreen后24小時，在脾臟和血液的人源T細胞中均檢測到強烈的ZsGreen表達。其中，CD8+ T細胞的轉染率和表達強度均高于CD4+ T細胞（脾臟中：88.7% vs 59.3% ZsGreen+），這與CD8+ T細胞表面CD7表達量更高相一致。

實驗小結：CD7-tLNP不僅在純化的T細胞中有效，在模擬體內(nèi)的復雜細胞環(huán)境中以及真實的活體動物模型內(nèi)，均能實現(xiàn)高效、特異性的mRNA遞送，展現(xiàn)了強大的轉化潛力。

四、功能驗證：高效生成功能性抗CD20 CAR-T細胞
研究對象與方法：研究最終檢驗了CD7-tLNP平臺的實際應用價值。將編碼抗CD20 CAR的mRNA封裝入CD7-tLNP，分別在體外和體內(nèi)生成CAR-T細胞，并評估其殺傷功能。

研究結果：

• 體外生成與殺傷：用CD7-tLNP-CAR處理人T細胞，可劑量依賴性地在CD4+和CD8+ T細胞中誘導高比例的CAR表達（最高劑量下可達48-76%）。這些體外生成的CAR-T細胞能有效殺傷CD20陽性的Raji細胞，呈現(xiàn)效應靶比依賴的細胞毒性。
• 體內(nèi)生成與清除：給人源化小鼠注射單劑CD7-tLNP-CAR（2.5 μg mRNA），24小時后即可在脾臟T細胞中檢測到顯著的CAR表達（CD4+平均33.3%，CD8+平均50.6%），效率顯著高于對照的CD2-tLNP-CAR。更重要的是，這些體內(nèi)原位生成的CAR-T細胞發(fā)揮了強大的功能，導致脾臟中CD20+ B細胞幾乎被完全清除（從約4-7%降至0.5%），免疫組化也顯示出強烈的Granzyme B表達。

實驗小結：CD7-tLNP平臺能夠在體內(nèi)外高效、快速地將治療性CAR mRNA遞送至T細胞，生成具有強大抗原特異性殺傷功能的CAR-T細胞，為基于mRNA的體內(nèi)細胞療法提供了強有力的工具。

小結
本研究通過系統(tǒng)性比較，確立了CD7作為體內(nèi)T細胞靶向mRNA遞送和CAR-T細胞工程的最優(yōu)受體。其突破性在于揭示了受體內(nèi)化能力是決定tLNP遞送效率的關鍵內(nèi)在機制，而非傳統(tǒng)認為的受體豐度。這一“內(nèi)化能力優(yōu)先”的原則為未來理性設計與篩選靶向配體提供了核心框架。靶向CD7的tLNP平臺憑借其高效、廣譜、兼具T細胞和NK細胞靶向能力等優(yōu)勢，為開發(fā)更簡便、安全、普惠的“現(xiàn)貨型”體內(nèi)CAR-T/CAR-NK療法鋪平了道路，有望突破當前細胞療法的制造與成本壁壘，應用于癌癥、自身免疫病、纖維化等多種疾病領域。