HTRF/AlphaLISA檢測p24的技術(shù)原理及優(yōu)勢

在細(xì)胞與基因治療如火如荼的今天，慢病毒作為關(guān)鍵載體，其生產(chǎn)質(zhì)控至關(guān)重要。無論是CAR-T、干細(xì)胞研究還是基因治療，精準(zhǔn)、快速地測定慢病毒滴度都是確保實(shí)驗(yàn)成功與一致性的第一步。而這一切，都離不開對慢病毒核心蛋白——p24抗原的精準(zhǔn)定量。

p24抗原

如圖1所示，免疫缺陷病毒（HIV）p24蛋白由231個(gè)氨基酸組成，構(gòu)成病毒衣殼的錐形核心，其內(nèi)部包裹著基因組RNA-核衣殼復(fù)合體。p24是p55 Gag多聚蛋白經(jīng)病毒蛋白酶切割后的產(chǎn)物。HIV p24及其55 kDa前體蛋白在HIV病毒的組裝、成熟與解離過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用�；�于HIV改造的慢病毒載體被廣泛用于向哺乳動物細(xì)胞遞送轉(zhuǎn)基因，而針對p24抗原的檢測已成為衡量慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的標(biāo)準(zhǔn)方法。

圖1. HIV病毒結(jié)構(gòu)（DOI: 10.12677/OJNS.2017.5202）

法規(guī)要求

《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》1.4 含量

病毒載體類產(chǎn)品可通過諸如總顆粒數(shù)、基因組拷貝數(shù)、結(jié)構(gòu)蛋白含量、感染性滴度或感染性顆粒數(shù)等檢測確定病毒含量。

《CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)》第四章第11條

除病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度外，還可通過檢測病毒載體特定抗原或病毒基因拷貝數(shù)來檢測病毒載體的物理滴度，如慢病毒載體p24抗原含量的檢測。

《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》4.1.3 病毒載體滴度

滴度是病毒載體生物學(xué)活性和含量的重要檢測項(xiàng)目，可用于工藝過程監(jiān)控和放行檢測，需選擇靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度等符合要求的檢測方法開展研究。鼓勵(lì)采用多種方法進(jìn)行滴度的檢測，并探索不同方法檢測數(shù)值的相關(guān)性。

AlphaLISA和HTRF原理

瑞孚迪基于AlphaLISA和HTRF技術(shù)平臺，提供p24蛋白高通量檢測試劑盒。相比傳統(tǒng)ELISA，均相檢測方法擁有約4個(gè)檢測范圍的線性區(qū)間，可有效減少稀釋、洗板等過程導(dǎo)致的結(jié)果偏差，提高結(jié)果準(zhǔn)確度和檢測效率。

HTRF檢測原理

如圖2所示，采用Eu標(biāo)記與d2標(biāo)記的抗HIV p24抗體，通過夾心法檢測HIV p24抗原。當(dāng)兩種標(biāo)記抗體結(jié)合抗原并相互靠近時(shí)，激發(fā)供體可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），使受體在665 nm處發(fā)出熒光，其信號強(qiáng)度與HIV p24濃度成正比。

圖2. HTRF檢測原理

AlphaLISA檢測原理

如圖3所示，分別標(biāo)記有供體微珠和受體微珠的兩種抗體同時(shí)與目標(biāo)分析物結(jié)合，使兩種微珠相互靠近。激發(fā)供體微珠產(chǎn)生的單線態(tài)氧可激活鄰近的受體微珠并在615 nm處產(chǎn)生信號，其信號強(qiáng)度與分析物濃度成正比。

圖3. AlphaLISA檢測原理

AlphaLISA和HTRF技術(shù)優(yōu)勢

更寬的動態(tài)范圍

如圖4所示，AlphaLISA技術(shù)可提供高達(dá)4個(gè)數(shù)量級的動態(tài)范圍，遠(yuǎn)超ELISA的約2個(gè)數(shù)量級。無需反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，一次檢測即可準(zhǔn)確定量差異巨大的樣本，也可有效避免hook效應(yīng)。

圖4. 檢測范圍（左：HTRF 52~10000pg/ml；右：AlphaLISA 10~100000pg/ml）

更便捷與高通量

免洗操作步驟大幅簡化流程和減少誤差，檢測流程約2h，易于實(shí)現(xiàn)自動化，兼容384孔板甚至更高通量的格式。

圖5. 檢測流程（左：HTRF；右：AlphaLISA）

更少的樣本消耗

HTRF僅需16μl，AlphaLISA僅需1~5μL樣本，對于珍貴樣本（如臨床前病毒樣品）尤為友好。

圖6. AlphaLISA檢測體系

同等的準(zhǔn)確性

研究證實(shí)，在最佳檢測范圍內(nèi)，AlphaLISA與ELISA所測得的p24滴度結(jié)果高度一致，確保了數(shù)據(jù)的可靠性。

圖7. p24 AlphaLISA與ELISA檢測結(jié)果

總結(jié)

隨著CAR-T與基因治療領(lǐng)域的快速發(fā)展，病毒載體生產(chǎn)質(zhì)控正面臨效率、精度與通量的全面挑戰(zhàn)。HTRF/AlphaLISA均相檢測技術(shù)憑借其更寬的動態(tài)范圍、更高的檢測通量與更少的樣本需求能夠直接響應(yīng)這些挑戰(zhàn)，成為推動創(chuàng)新療法從實(shí)驗(yàn)室邁向臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵賦能工具。

產(chǎn)品列表

*表示還有其他規(guī)格

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