樣本制備全流程之磁珠分選得率純度提升核心技巧

 目的細(xì)胞的純度與得率，是 “樣本制備” 與 “細(xì)胞分選” 兩大環(huán)節(jié)緊密銜接、共同作用的結(jié)果。

樣本制備是分選的 “源頭地基”：從組織保存、解離到預(yù)分選處理，每一步都為后續(xù)分選奠定基礎(chǔ)；而細(xì)胞分選本身，也需系統(tǒng)兼顧分選前準(zhǔn)備、過程操作與分選后處理的全程細(xì)節(jié)。只有兩端同時優(yōu)化，才能實現(xiàn)高純度、高得率的穩(wěn)定結(jié)果。本期我們將聚焦樣本制備全流程，拆解易被忽略的重要操作細(xì)節(jié)，助您從源頭提升分選效能，攻克實驗痛點! （分為上下兩篇噢）

樣本保存
單細(xì)胞懸液制備過程中，樣本獲取后若無法及時處理或需短途運輸，需進(jìn)行特殊保存處理，否則會影響細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)而直接影響細(xì)胞活率，導(dǎo)致后續(xù)分選實驗的得率和純度下降。樣本保存特殊處理建議如下：

組織樣本
組織樣本通常指非液體組織來源，可用商品化組織保存液保存，將組織完全浸于保存液中，4℃保存或運輸，可保證至少48h內(nèi)細(xì)胞活性無改變，極大降低細(xì)胞凋亡或死亡。

重要操作Tips：
（1）根據(jù)組織塊大小選擇對應(yīng)體積離心管，保證組織與保存液充分接觸，避免管體過大導(dǎo)致保存液浪費，過小則組織無法完全浸沒，局部細(xì)胞易干燥壞死。
（2）組織無需剪切，直接放入保存液中，否則會破壞細(xì)胞間連接，增加解離難度。

貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	保存時間
130-100-008	MACS Tissue Storage Solution	100ml	2-8℃，保持新鮮樣本活性 48h
130-129-552	MACS® Freezing Solution	50ml	2-8℃，保持樣本活性 72h
570911	OMICS-Guard Sample Preservation Buffer	50ml	2-8℃，保持樣本活性 72h
570908	BD Rhapsody cDNA Kit	12×1ml	2-8℃，保持樣本活性 72h
abs9474	組織保存液	100ml	2-8℃，保持樣本活性 72h

血液樣本
血液樣本可使用含特定抗凝劑如肝素鈉（abs47014863）等抗凝管保存，可保證至少24小時內(nèi)細(xì)胞活性與免疫學(xué)特性穩(wěn)定，有效避免細(xì)胞死亡及活力下降。

重要操作Tips：
（1）使用抗凝管收集血液樣本后應(yīng)立即輕柔顛倒抗凝管5-8 次，使抗凝劑與血液充分接觸，避免劇烈震蕩，否則會導(dǎo)致溶血。
（2）不同類型抗凝管保存時間有所不同，需根據(jù)實驗需求進(jìn)行選擇。如無法在規(guī)定時間內(nèi)完成單細(xì)胞懸液制備，可將目標(biāo)細(xì)胞分離出來，使用細(xì)胞凍存液程序性降溫后進(jìn)行長期凍存。
（3）血液樣本收集完成后，應(yīng)在室溫下直立保存運輸，且需及時檢測樣本質(zhì)量，避免因樣本降解、細(xì)胞損傷影響后續(xù)分選結(jié)果，同時需嚴(yán)格排查微生物污染，防止污染導(dǎo)致實驗失敗或數(shù)據(jù)偏差。

制備單細(xì)胞懸液
單細(xì)胞懸液的質(zhì)量是細(xì)胞分選成敗的關(guān)鍵，其制備的核心在于 “避免細(xì)胞過度解離” 與 “最大化保留細(xì)胞數(shù)量”之間的精準(zhǔn)平衡。針對不同來源的樣本，為您推薦如下解離方案：

實體組織樣本
- 機(jī)械法：通過物理作用，如研磨、過濾、吹打，分解質(zhì)地較軟或纖維含量少的組織樣本。此方法操作簡單、快速，成本低，但易造成組織細(xì)胞損傷，細(xì)胞分散不完全，解離效果較一般。

- 機(jī)械法操作tips：
- 組織樣本應(yīng)在冰浴或4℃解離，研磨緩沖液提前預(yù)冷，減少細(xì)胞代謝消耗和熱損傷。
- 研磨時輕柔按壓，不要過多研磨或用針頭或細(xì)口徑吸管強(qiáng)行吹打同一組織樣本，反復(fù)操作會損傷細(xì)胞。
- 應(yīng)根據(jù)目的細(xì)胞大小選擇合適參數(shù)的細(xì)胞篩網(wǎng)（30/70/100μm）過濾。

- 酶解法：通過消化酶，如膠原酶、胰蛋白酶等，分解如腫瘤、肝臟、腎臟等纖維含量高或質(zhì)地堅韌的組織。此方法能保持細(xì)胞完整性和活性，可選擇酶種類豐富多樣，但操作較繁瑣，消化時間長且難控制，可能影響細(xì)胞抗原表位識別。

- 酶解法操作tips：
- 根據(jù)不同組織類型選擇合適的酶解方案（見表1）。
- 可掃碼查看優(yōu)寧維專屬組織分離指南，幫助您根據(jù)目的細(xì)胞類型選擇適宜的解離酶與濃度。
- 酶液需提前在37℃水浴復(fù)溫，避免冷酶液直接加入樣本導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激。
- 酶解在 37℃或室溫孵育20-30min，每10 min輕柔搖晃離心管，以助組織分散，避免超時消化。

表1不同組織解離方案

酶種類	細(xì)分類型	貨號	特征
膠原酶	膠原酶 I	LS004196、abs47048000	用于上皮組織，肝，肺，脂肪和腎上腺組織樣本，可獲取淋巴細(xì)胞
	膠原酶 II	LS004176、abs47048001	較高的梭菌肽酶 A 含量，通常用于分解心臟，骨，肌肉，甲狀腺和軟骨瘤組織
	膠原酶 III	LS004180、abs47048002	低蛋白水解酶活性，普遍用于乳腺組織
	膠原酶 IV	LS004186、abs47048003	多種蛋白酶成分，能消化多種組織。胰酶活性低，用于消化胰島細(xì)胞及對細(xì)胞表面受體完整性有較高要求的實驗樣本
	膠原酶 V	LS005280、abs47048004	用于胰島小島、結(jié)締組織等
胰蛋白酶		LS003702、abs47014937、abs47047375、SV30031.02	需要配合膠原酶或彈性蛋白酶使用
木瓜蛋白酶		LS003126、abs47014927	用于皮層神經(jīng)元、視網(wǎng)膜、平滑肌等
DNA 消化酶		LS002139、abs47047435	適用于單細(xì)胞懸液制備中防止細(xì)胞成團(tuán)

3.GentleMACS組織解離系統(tǒng)：基于兩種傳統(tǒng)方法的融合創(chuàng)新，實現(xiàn)組織解離技術(shù)的全面革新。
該系統(tǒng)由組織處理器、組織解離試劑盒、專用耗材組成，處理器可外設(shè)加熱模塊或冷凍模塊實現(xiàn)溫和細(xì)胞或細(xì)胞核解離，解離過程高效、自動化、標(biāo)準(zhǔn)化可重復(fù)，獲得細(xì)胞活性高、抗原表位被極大保護(hù)，可保障下游實驗結(jié)果真實可靠。

圖1. GentleMACS組織解離系統(tǒng)

GentleMACS組織解離系統(tǒng)操作過程：以腫瘤組織為例

先將預(yù)處理的組織樣本與適量酶解緩沖液一并放入專用 gentleMACS 組織解離管。然后將解離管置于主機(jī)上，通過預(yù)設(shè)或自定義程序進(jìn)行自動化解離。程序完成后，取出解離管，即可通過過濾或離心快速獲得高質(zhì)量單細(xì)胞懸液。

雖然流程清晰簡單易懂，但為確保解離效能，小優(yōu)總結(jié)以下高頻問題給大家提前避坑：

Q1. MACS組織解離專用耗材C管與M管分別適用于哪種實驗場景？

需注意！gentle MACS組織處理器必須與組織解離管配套使用，避免因使用不兼容的耗材導(dǎo)致儀器損壞、程序錯誤或樣本損失。

Q2. GentleMACS組織解離系統(tǒng)操作過程中是否需要人為干預(yù)？         
選好程序啟動后，設(shè)備即進(jìn)入全自動流程，無需人工值守與手動干預(yù)。該設(shè)計可規(guī)避不同操作者手法差異與計時誤差，能夠?qū)崿F(xiàn)解離結(jié)果的高度標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)性與一致性，大幅提升實驗效率與可靠性。

Q3. GentleMACS組織解離系統(tǒng)是否只能提取細(xì)胞？
不僅能提取細(xì)胞，還可通過搭配Cooler模塊與專用耗材（#130-130-533），快速、溫和獲取細(xì)胞核。該系統(tǒng)能在保持細(xì)胞核完整性與活性的同時，確保高重復(fù)性與標(biāo)準(zhǔn)化流程。

Q4. GentleMACS組織解離系統(tǒng)還有哪些特殊應(yīng)用?
該系統(tǒng)還可適配心臟或肝臟灌流等特殊前處理。通過特定灌流程序與專用耗材（#130-128-151），實現(xiàn)自動化、可控的器官原位灌流，高效清除血液并均勻分布消化酶，顯著提升細(xì)胞得率與活性。

Q5. 針對樣本罕見，沒有專屬試劑盒怎么辦？
美天旎通用型多組織解離試劑盒，如 Multi Tissue Dissociation Kit 1/2（#130-110-201/ 130-110-203）可提供標(biāo)準(zhǔn)化的替代方案。該試劑盒1型和2型核心區(qū)別在于分別適配不同組織類型與酶解策略（見表2）。此外，也可在通用試劑盒基礎(chǔ)上，調(diào)整酶解時間、溫度，或補加特定酶（如透明質(zhì)酸酶）進(jìn)行實驗條件優(yōu)化。

表2 Multi Tissue Dissociation Kit 1型/2型核心區(qū)別

特性	Multi Tissue Dissociation Kit 1	Multi Tissue Dissociation Kit 2
核心設(shè)計	溫和、標(biāo)準(zhǔn)型	強(qiáng)力、復(fù)雜型
主要酶組成	主要含膠原酶和分散酶，作用相對溫和	含膠原酶、分散酶、彈性蛋白酶及更高活性的酶，酶系更全面、作用更強(qiáng)
適用組織類型	適用于標(biāo)準(zhǔn)、較易解離的軟組織 •脾臟、胸腺、淋巴結(jié) • 肝臟、腎臟 • 某些腫瘤組織	適用堅韌、纖維化或特別復(fù)雜組織 • 實體瘤（尤其纖維化腫瘤） • 心臟、大腦 • 皮膚、脂肪 • 纖維化或硬化組織

Q6. 組織上機(jī)前是否需要預(yù)剪切？
預(yù)剪切并非固定步驟，關(guān)鍵取決于組織類型。為確保解離效果一致，避免過度解離或細(xì)胞損傷，建議嚴(yán)格按照說明書要求判斷是否預(yù)先剪切。

Q7. 腫瘤組織如何選用合適的組織處理器操作程序？（以人腫瘤組織解離試劑盒#130-095-929為例）
需判斷組織軟硬程度，選擇對應(yīng)的研磨程序類型（如圖2）。搭配對應(yīng)組織處理器和組織解離試劑盒提供的研磨程序進(jìn)行選擇。軟組織（如黑色素瘤、結(jié)腸癌等）優(yōu)先選溫和研磨程序，減少細(xì)胞損傷；硬組織（如乳腺癌、胰腺癌、肝癌等）可選用加強(qiáng)研磨程序，保障解離充分。 根據(jù)軟硬程度選擇好適配的程序類型后，也需注意解離儀器不同，對應(yīng)的操作程序也有所不同，具體如下：

圖2 腫瘤組織軟硬程度分類

（1）若使用帶加熱功能的 gentleMACS™ Octo 解離儀器，根據(jù)下表選擇適宜程序，運行結(jié)束后可直接按說明書操作進(jìn)行下一步。

圖3 加熱款腫瘤組織研磨程序示例

（2）若使用常規(guī)gentleMACS™解離儀或非加熱模式的gentleMACS Octo 解離儀，無論腫瘤是柔軟、中等硬度還是堅硬型，首先統(tǒng)一運行 gentleMACS 程序 h_tumor_01，按說明書操作步驟處理后，進(jìn)行第二次程序（如圖4）。運行結(jié)束后，進(jìn)行第三次程序處理（如圖5）。

圖4 常規(guī)款腫瘤組織研磨程序示例1	圖5 常規(guī)款腫瘤組織研磨程序示例2

Q8. 罕見組織樣本找不到對應(yīng)的組織解離程序怎么辦？
罕見組織樣本沒有特定標(biāo)準(zhǔn)化解離程序，可咨詢優(yōu)寧維技術(shù)獲取推薦方案，也可參考說明書中的通用程序摸索最佳處理方案！

Q9. 沒有Gentle MACS組織處理器，可以單獨用解離試劑盒嗎？
可以，因為美天旎的試劑盒是經(jīng)過嚴(yán)格篩選與優(yōu)化配比的優(yōu)質(zhì)酶解方案。若解離試劑盒不搭配儀器使用，可參考解離試劑盒說明書中“通道2”程序的運行時間（如圖3），自行摸索酶濃度優(yōu)化實驗條件。

圖6 說明書“通道2“程序示例

Q10. 單次實驗上機(jī)樣本量是多少？
需根據(jù)實際樣本量折算，但要嚴(yán)格根據(jù)樣本量添加解離試劑（如圖4），避免因試劑不足影響解離效率。

圖7 以腫瘤組織解離試劑盒說明書為例

MACS組織解離熱賣產(chǎn)品：

品類	貨號	產(chǎn)品名稱
組織處理器	130-093-235	gentleMACS™ Dissociator
	130-134-029	gentleMACS™ Octo Dissociator with Heaters
組織解離試劑盒	130-095-927	Lung Dissociation Kit, mouse
	130-095-929	Tumor Dissociation Kit, human
	130-096-730	Tumor Dissociation Kit, mouse
專用耗材	130-093-237	gentleMACS™ C Tubes
	130-093-236	gentleMACS™ M Tubes
	130-128-151	gentleMACS™ Perfusers
	130-134-029	GentleMACS Octo with Heater
	130-130-533	gentleMACS™ Octo Coolers

血液樣本
如何根據(jù)不同需求選擇合適的外周血處理方法？

裂紅法與密度梯度離心法實驗流程及操作tips
1.裂紅法： 特異性裂解紅細(xì)胞，富集有活白細(xì)胞，以制備細(xì)胞懸液。

- 操作tips：
- 溶血素需4℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配；若操作小鼠或大鼠的血源樣本，操作溫度建議升至37℃，適當(dāng)增加孵育時間
- 裂紅體積應(yīng)在全血體積的3-5倍左右，建議裂紅3-5 min。避免裂解時間過長損傷細(xì)胞抗原表位及細(xì)胞狀態(tài)，時間過短則裂解不充分。

裂紅試劑熱賣產(chǎn)品：

貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
130-094-183	Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	50mL
abs9241	紅細(xì)胞裂解液（10x）	100mL/500ml
abs9101	紅細(xì)胞裂解液（1x）	100mL/500ml
555899	BD FACSTM Lysing Solution（10X）（不含固定劑）	100mL
349202	BD FACSTM Lysing Solution 10X Concentrate（含固定劑）	100mL

2.密度梯度離心：使用密度梯度介質(zhì)，利用細(xì)胞密度差異實現(xiàn)分層，富集目標(biāo)細(xì)胞。

- 操作tips：
- 根據(jù)樣本來源及目標(biāo)細(xì)胞類型，選用對應(yīng)密度參數(shù)的Ficoll分離細(xì)胞。且使用前需恢復(fù)至室溫（18-20℃），以確保最佳分離效果

常用分離細(xì)胞Ficoll密度參數(shù)如下：
1.077 g/mL：分離人外周血、臍帶血及骨髓中單個核細(xì)胞
1.073 g/mL：人基質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）等低密度細(xì)胞
1.084 g/ml：分離大鼠、小鼠血液及骨髓中單個核細(xì)胞

- 合適的分離溫度應(yīng)保持在18-20°C。溫度過高分離介質(zhì)密度較低，影響分離效果及細(xì)胞活性；溫度過低，PBMC無法有效富集于分離膠界面，導(dǎo)致分層模糊、紅細(xì)胞污染及細(xì)胞回收率顯著下降。

- 離心過程中，離心機(jī)應(yīng)緩升緩降，避免因離心機(jī)震動影響細(xì)胞分層

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圖8. 密度梯度離心分層示意圖 

細(xì)胞分離相關(guān)產(chǎn)品：

貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	適用細(xì)胞類型
17089109	PERCOLL	6x1L	通用細(xì)胞分離，可用來分離中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞、病毒等
17544501	PERCOLL PLUS	1L
abs9102	細(xì)胞分離液	100mL
17144002	FICOLL PAQUE PLUS 1.077	6x100mL	人外周血，臍帶血，組織中分離單個核細(xì)胞，其中PREMIUM為更高級別細(xì)胞分離液，內(nèi)素更低，可用于臨床研究。
17144003	FICOLL PAQUE PLUS 1.077	6x500mL
17544202	FICOLL PAQUE PREMIUM 1.077	6x100mL
17544203	FICOLL PAQUE PREMIUM 1.077	6x500mL
abs930	人淋巴細(xì)胞分離液	200mL
17544602	FICOLL PAQUE PREMIUM 1.084	6x100ML	大 / 小鼠、血液、骨髓、組織中分離單個核細(xì)胞
17544652	FICOLL PAQUE PREMIUM 1.073	6x100ML	人低密度細(xì)胞，如基質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞

優(yōu)化細(xì)胞懸液質(zhì)量
我們獲得的單細(xì)胞懸液可能會有一些細(xì)胞團(tuán)塊、細(xì)胞碎片、死細(xì)胞等影響后續(xù)分選過程如干擾磁珠標(biāo)記、堵塞分選柱，導(dǎo)致細(xì)胞分選純度與得率下降。因此，我們可以選用以下細(xì)胞優(yōu)化試劑提升細(xì)胞質(zhì)量：
1.篩網(wǎng)過濾：使用孔徑適宜的細(xì)胞篩網(wǎng)對粗提細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，以去除未充分解離的組織團(tuán)塊。(MACS® SmartStrainers70μm#130-098-462或70um細(xì)胞篩網(wǎng)#abs7232）

2.碎片去除試劑：利用密度梯度離心的原理快速、有效去除細(xì)胞碎片（Debris Removal Solution#130-109-398或細(xì)胞分離液#abs9102）

3.死細(xì)胞去除：磁珠標(biāo)記死細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸，通過高強(qiáng)度磁場，將死細(xì)胞去除（ Dead Cell Removal Kit #130-090-101）

4.裂紅試劑：利用滲透壓差，裂解無核紅細(xì)胞。（Red Blood Cell Lysis Solution (10×)#130-094-183或紅細(xì)胞裂解液（1×）#abs9101）

注：若您后續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，則不需要裂紅；若是磁珠分選或測序，則需要進(jìn)行裂紅和細(xì)胞碎片去除

細(xì)胞狀態(tài)評估
經(jīng)質(zhì)量優(yōu)化后的單細(xì)胞懸液需評估細(xì)胞活性，確保細(xì)胞活率＞85%，以保證磁珠標(biāo)記效率獲得理想的分選結(jié)果。

1.血球計數(shù)板：

 

圖9. 血球計數(shù)板示意圖

- 用無水乙醇（或 95%）擦拭計數(shù)板，晾干，取一張干凈蓋玻片覆在計數(shù)板上
- 滴加適量單細(xì)胞懸液，確保無氣泡且分布均勻
- 顯微鏡觀察，計數(shù)四角方格的細(xì)胞，遵循“計上不計下、計左不計右”原則
- 按公式計算濃度與活率：
濃度（cells/mL）=（四大格細(xì)胞總數(shù)÷4）×稀釋倍數(shù)×10⁴；
活率（%）=（活細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)）×100%

2.細(xì)胞計數(shù)儀：

 

圖10. 細(xì)胞計數(shù)儀操作示意圖

（1）將單細(xì)胞懸液按說明書比例與臺盼藍(lán)（abs42028917）染液混合
（2）取10-20μL混合液加至專用計數(shù)板 
（3）計數(shù)板插入儀器指定卡槽，等待讀取細(xì)胞濃度、活率及粒徑分布等數(shù)據(jù)

注：若目的細(xì)胞比例過高（≥90%），超出磁珠的最大上限量，應(yīng)重新評估分選的必要性，優(yōu)先考慮直接使用或選擇陰性去除方案。