IL-5單抗Depemokimab在“蛋白-細(xì)胞-整體”三個(gè)層面的長(zhǎng)效原理解析

12月16日，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)英國(guó)葛蘭素史克公司（GSK）的“半年一次”超長(zhǎng)效IL-5單抗Depemokimab（Exdensur）用于治療哮喘和慢性鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）�，F(xiàn)有治療哮喘的生物制劑需每 4–8 周給藥，患者一年要跑 6–13次醫(yī)院，Depemokimab半年一針，為患者帶來(lái)極大便利性。它能否橫掃嗜酸哮喘市場(chǎng)？

一、靶點(diǎn)與分子工程
Depemokimab的靶點(diǎn)蛋白是IL-5 。IL-5是同源二聚體，每條鏈115aa，存在二硫鍵，鎖定了“螺旋束”構(gòu)象。

IL-5是嗜酸細(xì)胞的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子，靶點(diǎn)途徑為IL-5結(jié)合IL-5Rα受體，招募β鏈（與 IL-3/GM-CSF共享），使JAK2/STAT5磷酸化，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。

圖：IL-5/IL-5R通路示意圖
From：doi: 10.3389/fphys.2019.01514

Depemokimab的“半年一針”長(zhǎng)效性并非單一因素造就，而是“高親和力＋FcRn回收增強(qiáng)＋清除減慢”三重分子設(shè)計(jì)的疊加結(jié)果。下面按“蛋白-細(xì)胞-整體”三個(gè)層次拆解其長(zhǎng)效原理，并給出關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

1.  蛋白層面
Depemokimab與IL-5的α-螺旋形成“鉗形”包埋，幾乎蓋住 IL-5Rα 的對(duì)接位點(diǎn)，阻止IL-5的信號(hào)傳導(dǎo)。復(fù)合物一旦形成，不會(huì)快速解離，可穩(wěn)定存在數(shù)小時(shí)至數(shù)天。血漿中幾乎全部IL-5被抗體“中和”，游離 IL-5幾乎測(cè)不到，為后續(xù)“長(zhǎng)半衰期”奠定藥效學(xué)基礎(chǔ)。

2.  細(xì)胞層面
Fc段是抗體的一個(gè)重要部分，它與免疫系統(tǒng)的其他成分（如Fcγ受體）相互作用，從而影響抗體的半衰期。Depemokimab的Fc段進(jìn)行了M252Y/S254T/T256E（YTE）的工程化改造，改變抗體藥物在體內(nèi)的回收。在內(nèi)吞體（endosome）酸性環(huán)境pH 6.0里，藥物與Fc受體結(jié)合更牢，避免被溶酶體降解。血流恢復(fù)中性pH7.4后迅速解離，抗體重新進(jìn)入循環(huán)。具體來(lái)說(shuō)，這些改造能：

①減少與內(nèi)源性受體的結(jié)合：減少Depemokimab與肝臟和脾臟細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而延緩其在體內(nèi)的清除。

②增強(qiáng)與Fcγ受體的親和力：與免疫系統(tǒng)中的受體結(jié)合更為穩(wěn)定，藥物在體內(nèi)停留的時(shí)間更長(zhǎng)。

③增強(qiáng)與半衰期相關(guān)的特性：使抗體-IL-5復(fù)合物不被腎臟快速濾過(guò)，亦不被肝臟清除，藥物在體內(nèi)的代謝速度減緩，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。

這種Fc段的改造提高了藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特性，使得Depemokimab能夠在體內(nèi)維持較高濃度的有效成分，從而減少給藥頻率。

3.  整體層面
除了Fc段的改造外，Depemokimab的分子設(shè)計(jì)可能還包括可減少免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除，減少肝臟代謝等機(jī)制，以進(jìn)一步延長(zhǎng)其在體內(nèi)的停留時(shí)間。

4. 延長(zhǎng)半衰期的藥代動(dòng)力學(xué)特性
通過(guò)Fc段改造和抗原結(jié)合的優(yōu)化，Depemokimab表現(xiàn)出延長(zhǎng)的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期。

延長(zhǎng)的半衰期使得Depemokimab相比傳統(tǒng)的單克隆抗體具有更長(zhǎng)的作用時(shí)間，可以減少患者的給藥次數(shù)。

5. 持續(xù)治療效果和患者依從性
由于Depemokimab能夠保持長(zhǎng)時(shí)間的效果，患者在接受治療時(shí)能夠享受持續(xù)的臨床改善，例如減少過(guò)敏癥狀、減少哮喘發(fā)作等。長(zhǎng)效的特點(diǎn)不僅減少了治療頻率，還能提高患者的治療依從性，因?yàn)榛颊卟恍枰�頻繁去醫(yī)院或注射藥物。

圖：Depemokimab工作原理

二、IL5單抗研究相關(guān)檢測(cè)
（一） TR-FRET高通量藥物篩選（快速1h檢測(cè)）
蛋白A與蛋白B之間的相互作用是通過(guò)使用Eu標(biāo)記的抗Tag1抗體（TR-FRET供體）和 Accepter標(biāo)記的抗Tag2抗體（TR-FRET受體）檢測(cè)的。由于蛋白A與蛋白B結(jié)合介導(dǎo)供體抗體與受體抗體接近，供體抗體的激發(fā)會(huì)觸發(fā)向受體抗體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），使受體抗體特異性發(fā)射665nm波長(zhǎng)的信號(hào)。該特定信號(hào)與蛋白A與蛋白B相互作用的程度成正比。該均相實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，無(wú)需洗滌步驟。

檢測(cè)步驟簡(jiǎn)述如下：
在96/384淺孔板中加入4ul蛋白A，4ul蛋白B，2ul藥物（抗體/多肽等），10ul抗體混合溶液。室溫孵育1h，使用酶標(biāo)儀320 nm 激發(fā)，615和665 nm 雙波長(zhǎng)讀取。隨著藥物（抗體等）濃度梯度增加，蛋白A（B）被競(jìng)爭(zhēng)，F(xiàn)RET信號(hào)下降，得到IC50 曲線。

（二）信號(hào)通路檢測(cè)（磷酸化蛋白）
1、THUNDER TR-FRET磷酸化檢測(cè)試劑盒
以Phospho-STAT5為例
THUNDER TR-FRET采用經(jīng)典的雙抗夾心檢測(cè)模型檢測(cè)STAT5水平，兩個(gè)標(biāo)記了熒光Eu和FR的抗體分別識(shí)別STAT6磷酸化表位和穩(wěn)定區(qū)表位，抗體結(jié)合拉進(jìn)熒光基團(tuán)，320nm激發(fā)后進(jìn)而產(chǎn)生FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移），從而在665nm檢測(cè)熒光信號(hào)值。

THUNDER檢測(cè)技術(shù)特異性好，靈敏度高，重復(fù)性好，通量高，操作簡(jiǎn)單，手動(dòng)15min即可完成實(shí)驗(yàn)。

圖：THUNDER TR-FRET磷酸化STAT5檢測(cè)原理及操作流程

圖：THUNDER TR-FRET磷酸化STAT5在A431細(xì)胞驗(yàn)證數(shù)據(jù)

2、WB和流式抗體
Phospho-Stat5 (Tyr694) Recombinant Rabbit為例

圖左：WB result of Phospho-Stat5 (Tyr694) Recombinant Rabbit mAb.Primary antibody: Phospho-Stat5 (Tyr694) Recombinant Rabbit mAb at 1/1000 dilution.Lane 1: untreated,A431 whole cell lysate 20 µg. Lane 2: A431 treated with 100 ng/ml EGF for 5 minutes whole cell lysate 20 µg.Secondary antibody: Goat Anti-rabbit IgG, (H+L), HRP conjugated at 1/10000 dilution.Predicted MW: 91 kDa.Observed MW: 90 kDa.

圖右：Flow cytometric analysis of 4% PFA fixed 90% methanol permeabilized human peripheral blood T lymphocytes, treated with CD3, CD28 beads (Right panel) or untreated (Left panel), labeling Phospho-Stat5 (Tyr694) antibody at 1/200 dilution (0.25 μg)/ (Red) compared with a Rabbit monoclonal IgG (Black) isotype control and an unlabelled control (cells without incubation with primary antibody and secondary antibody) (Blue). Goat Anti - Rabbit IgG Alexa Fluor® 488 was used as the secondary antibody.

（三）細(xì)胞因子檢測(cè)（Biomarker檢測(cè)）
1、THUNDER TR-FRET細(xì)胞因子檢測(cè)
Human CCL17/TARC為例——專利用品
THUNDER細(xì)胞因子檢測(cè)是基于雙抗體夾心法，標(biāo)記熒光供體和受體的CCL17抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細(xì)胞上清中CCL17結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進(jìn)而產(chǎn)生665nm熒光信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與CCL17濃度成正比。全程僅需1h，免洗，可高通量。檢測(cè)靈敏度高，上限寬。

Human CCL17/TARC檢測(cè)范圍：2.4-30000pg/ml

圖：Human CCL17/TARC 檢測(cè)原理，流程及標(biāo)曲

Human IL4 檢測(cè)范圍：6.4–30000 pg/ml

圖：Human IL4檢測(cè)原理，流程及標(biāo)曲

2、OneStep ELISA細(xì)胞因子檢測(cè)
OneStep ELISA開(kāi)發(fā)標(biāo)簽抗體捕獲技術(shù)，板底包被標(biāo)簽抗體，可高靈敏捕獲雙抗夾心復(fù)合物，搭配高特異性重組單抗，一步即可在溶液中形成抗體-分析物夾心復(fù)合物�？奢p松準(zhǔn)確定量蛋白。僅需1h，即可定量細(xì)胞因子。

Human IL-13為例，Range：3.9pg/ml-250pg/ml。

圖：OneStep ELISA檢測(cè)原理及Human IL13標(biāo)曲數(shù)據(jù)

（四）過(guò)敏原IgE檢測(cè)

Human IgE OneStep ELISA Kit

圖左：Standard curve：Range 0.156 ng/mL–10 ng/mL。

圖右：To assess the linearity of the assay, three samples were spiked with high concentrations of Human IgE in various matrices and diluted with the appropriate Calibrator Diluent to produce samples with values within the dynamic range of the assay.

相關(guān)產(chǎn)品推薦

TR-FRET檢測(cè)抗體（結(jié)合binding實(shí)驗(yàn)用）
產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
Eu-anti-6xHis	EUHIS-1000	1000 pionts
FR-streptavidin	FRSA-1000	1000 pionts
其他抗體：anti-FLAG，anti-GST，anti-Fc，anti-mFc，anti-RFc標(biāo)簽均可提供
磷酸化蛋白檢測(cè)試劑盒及抗體
產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
Phospho-STAT5 (Y694/Y699)	KIT-STAT5P-500	500 pionts
Total STAT5	KIT-STAT5T-500	500 pionts
Phospho-STAT6 (Y641)	KIT-HP-STAT6P-500	500 pionts
Total STAT6	KIT-HP-STAT6T-500	500 pionts
THUNDER™ Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	KIT-XTM-ERKP-500	500 points
Phospho-AKT pan (S473)	KIT-AKTS473P-500	500 points
Phospho-AKT pan (T308)	KIT-AKTT308P-500	500 points
Phospho-Stat6 (Tyr641) Recombinant Rabbit mAb	S0B6101	100ul
S-RMab®Stat6 Recombinant Rabbit mAb	S0B0085	100ul
STAT5 Recombinant Rabbit mAb	S0B0305	100ul
Phospho-Stat5 (Tyr694) Recombinant Rabbit mAb	S0B0851	100ul
細(xì)胞因子檢測(cè)（TR-FRET法）
產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
Human CCL17/TARC	KIT-CCL17-500	500 pionts
Mouse CCL17/TARC	KIT-MCCL17-500	500 pionts
Human IL-4	KIT-IL4-500	500 pionts
Human IL-6	KIT-IL6-500	500 pionts
Mouse IL-6	KIT-MIL6-500	500 pionts
細(xì)胞因子檢測(cè)（One Step ELISA法）
產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
Human CCL17	S0C3072	96T
Human IL-4	S0C3047	96T
Human IL-5	S0C3009	96T
Human IL-6	S0C3004	96T
Human IL-13	S0C3003	96T
IgE檢測(cè)（One Step ELISA法）
產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
Human IgE	S0C3042	96T
Mouse IgE	S0C3060	96T
Rat IgE	S0C3037	96T
TR-FRET Binding試劑盒及耗材
產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
Human IL2/IL2R Binding Kit	UA086010-500T	500T
Human IL6/IL6R Binding Kit	UA086013-500T	500T
Human IL10/IL10RA Binding Kit	UA086016-500T	500T
Human IL6/IL6R Binding Kit	UA086013-500T	500T
微孔板（384孔板，白色，淺孔）	abs7311	1箱