共表達(dá)提高CHO細(xì)胞的克隆效率和蛋白質(zhì)產(chǎn)量

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于生物制藥行業(yè)，特別是用于生產(chǎn)單克隆抗體和重組蛋白藥物。重組細(xì)胞系通常來(lái)源于單細(xì)胞克隆，以確保產(chǎn)品的一致性和穩(wěn)定性。然而，難以表達(dá)的重組蛋白可能會(huì)抑制單細(xì)胞增殖，從而顯著降低克隆效率。如何提高“難表達(dá)蛋白”的單克隆化效率和重組蛋白產(chǎn)量呢，齊魯制藥新發(fā)表在《Protein Expression and Purification》上的文章提供了新思路。

 
研究?jī)?nèi)容
 
1. 問(wèn)題背景：

CHO細(xì)胞是生產(chǎn)治療性蛋白（如單克隆抗體）的關(guān)鍵平臺(tái)，但表達(dá)“難表達(dá)蛋白”時(shí)會(huì)顯著抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致單克隆化效率低（即單細(xì)胞形成克隆的成功率低），延緩細(xì)胞株開(kāi)發(fā)進(jìn)程。

2. 創(chuàng)新策略：
 
構(gòu)建共表達(dá)載體 pCGS3.0-IGF1-P04，將胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1，其可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程并抑制凋亡。）基因通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）與目標(biāo)難表達(dá)蛋白 P04 串聯(lián)，轉(zhuǎn)染至 CHOZN® GS-/-細(xì)胞中。IGF-1共表達(dá)通過(guò)顯著提高克隆效率并實(shí)現(xiàn)難以表達(dá)蛋白的穩(wěn)定生產(chǎn)，代表了一種有效的單細(xì)胞克隆策略。
 

 
3. 關(guān)鍵技術(shù)：

使用 Cytena Single-Cell Printer™ 進(jìn)行全自動(dòng)單細(xì)胞分選，確保單克隆源性。

- 通過(guò)成像系統(tǒng)追蹤單細(xì)胞增殖，定量克隆效率。 
- 在兩種培養(yǎng)基（A/B）中評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白產(chǎn)量及代謝參數(shù)。

IGF-1共表達(dá)使細(xì)胞的單克隆效率在Medium A中為53.3%，較對(duì)照組提高了196%；在Medium B中為89%，較對(duì)照組提高了53%。

首先，使用 Cytena Single-Cell Printer進(jìn)行自動(dòng)單細(xì)胞分選。隨后，使用成像儀監(jiān)測(cè)單克隆細(xì)胞的鋪板效率和生長(zhǎng)。到第14天，在兩種培養(yǎng)基中，IGF-1共表達(dá)克隆細(xì)胞表現(xiàn)出比對(duì)照細(xì)胞顯著更高的匯合度和增殖能力。

在分選當(dāng)天（第 0 天），所有組的單細(xì)胞鋪板效率在95%到97%之間（圖A）。根據(jù)第0天和第1天收集的成像數(shù)據(jù)，證實(shí)了所有組的單細(xì)胞鋪板效率約為90%（圖B）。根據(jù)Cytena Single-Cell Printer與成像儀的圖像數(shù)據(jù)，計(jì)算出所有組均達(dá)到 >99% 的單克隆源性（圖C）。這些結(jié)果表明所有組的分選效率高且相當(dāng)。到第14天，在培養(yǎng)基A和B中，IGF-1共表達(dá)細(xì)胞的匯合度分別比對(duì)照高出35%和24%（圖D）。培養(yǎng)20天后，IGF-1共表達(dá)細(xì)胞的克隆效率顯著高于對(duì)照細(xì)胞：在培養(yǎng)基A中為53.3%（相對(duì)于對(duì)照增加了 196%，p< 0.001），在培養(yǎng)基B中為 89%（增加了 53%，p< 0.01）（圖E）。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明IGF-1共表達(dá)顯著增強(qiáng)了單細(xì)胞增殖和克隆效率，并且在不同培養(yǎng)條件下均表現(xiàn)出穩(wěn)健的性能。因此，該策略代表了優(yōu)化生物制藥開(kāi)發(fā)中單細(xì)胞克隆的一項(xiàng)重大進(jìn)展。

- 單克隆細(xì)胞密度（VCD）提高29–64%； 
- 目標(biāo)蛋白 P04 產(chǎn)量提升47–89%，主要源于細(xì)胞增殖加速而非單位細(xì)胞生產(chǎn)率（qP）變化。 

為了研究IGF-1共表達(dá)對(duì)單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)的影響，使用兩種培養(yǎng)基（培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B）在125 mL 搖瓶中進(jìn)行了批次實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在兩種培養(yǎng)基中，共表達(dá)IGF-1的克隆的平均 VCD 顯著高于未共表達(dá)IGF-1的克隆，在培養(yǎng)基A中增加了64%（p<0.001），在培養(yǎng)基B中增加了29%（圖A, p<0.01）。兩組的細(xì)胞活力均保持在 >90%（圖B），表明IGF-1共表達(dá)在維持高活力的同時(shí)有效促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，在兩種培養(yǎng)基中，共表達(dá)IGF-1的克隆的產(chǎn)品產(chǎn)量均顯著高于未共表達(dá)IGF-1的克隆，在培養(yǎng)基A和B中平均分別增加了89%和47%（圖C, p<0.05）。有趣的是，在IGF-1共表達(dá)組和非共表達(dá)組之間未觀察到 qP 的顯著差異（圖D）。這些結(jié)果表明，產(chǎn)品產(chǎn)量的增加可能主要源于細(xì)胞生長(zhǎng)的增強(qiáng)，而不是 qP 的變化。

共表達(dá)克隆的葡萄糖/谷氨酸消耗增加，乳酸積累略有增加（這可能是葡萄糖消耗增加的結(jié)果）（見(jiàn)下圖），表明IGF-1改善了能量代謝效率。 

4.長(zhǎng)期穩(wěn)定性：

連續(xù)培養(yǎng)60代后，蛋白產(chǎn)量波動(dòng)<15%，關(guān)鍵質(zhì)量屬性（如SEC純度）及IGF-1轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定（見(jiàn)下圖），符合工業(yè)化生產(chǎn)要求。

 
結(jié)論

IGF-1共表達(dá)是一種高效、穩(wěn)定的單克隆化策略，能顯著克服難表達(dá)蛋白對(duì)CHO細(xì)胞增殖的抑制，提升克隆效率與產(chǎn)量，且不影響長(zhǎng)期生產(chǎn)穩(wěn)定性。結(jié)合自動(dòng)化設(shè)備（如Cytena單細(xì)胞打印機(jī)），該方法可加速高產(chǎn)量細(xì)胞株的開(kāi)發(fā)，為生物制藥提供可靠解決方案。