預(yù)活化層析填料的介紹與應(yīng)用案例分享

親和層析的特異、靈敏性及快速高效等特點(diǎn)，使其在生物制藥、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、臨床診斷等多個(gè)領(lǐng)域都有重要應(yīng)用。然而市售成熟的相關(guān)介質(zhì)并非完全能夠匹配所研項(xiàng)目需求，因此自制親和填料成為理想工具之一。

預(yù)活化層析填料可以偶聯(lián)一個(gè)特定的配基，制備成一個(gè)可以純化一種或者幾種目標(biāo)分子的親和填料。例如，可以使用抗體、抗原、酶、受體、小的核酸或者多肽作為配基，純化能與它們結(jié)合的相應(yīng)的配體。

• 偶聯(lián)溶液A：1mM HCl 

• 偶聯(lián)溶液B：0.1M NaHCO3、0.5M NaCl，pH 8.3

取已知體積介質(zhì)于砂芯漏斗中，用預(yù)冷的偶聯(lián)溶液 A（0~4℃）洗滌，至少洗 30min，1ml 介質(zhì)用約 20ml 的偶聯(lián)溶液 A 洗滌；注意：NHS 對(duì)應(yīng)配基在 pH 較高時(shí)會(huì)迅速水解。

配基用偶聯(lián)溶液 B 溶解，或用 Bestdex G-25 層析柱置換于偶聯(lián)溶液 B 中（配基偶聯(lián)濃度 5~10mg/ml 填料）。將洗好的介質(zhì)用偶聯(lián)溶液 A 稀釋?zhuān)?ml 介質(zhì)約 0.5ml 偶聯(lián)溶液 A），并與配基溶液等體積混合，室溫混勻 4h 或 4℃ 攪拌過(guò)夜（不能使用磁力攪拌器）。

• 說(shuō)明：在室溫下，偶聯(lián)過(guò)程通常非�？欤�因此，通過(guò)優(yōu)化偶聯(lián)時(shí)間來(lái)維持配基的生物活性是很重要的 (先準(zhǔn)備配基再進(jìn)行填料的換液處理)。

• 封閉：抽去偶聯(lián)上清并加入封閉液（0.1M Tris-HCl，pH 8.5），室溫封閉 2~4h；

• 清洗： 0.1M Tris-HCl+0.5M NaCl， pH 8~9 與 0.1M 醋酸鹽緩沖液+0.5M NaCl，pH 3~4 交替洗滌 3~6 次，每次用 3 倍凝膠體積的液體洗滌；

• 用 PBS 清洗后使用或保存于 20% 乙醇中（配基必須在 20% 乙醇中穩(wěn)定）。

抗原作為配基實(shí)現(xiàn)多克隆抗血清的高通量純化該案例是將特定的抗原偶聯(lián)到預(yù)活化的填料上，制備成專(zhuān)用的親和層析柱，從多克隆抗血清中純化特異性的抗體。

一般情況下，當(dāng)配基分子量＜5KDa時(shí)使用間隔臂，而對(duì)于大分子，間隔臂非必須。例如，NHS 預(yù)活化填料的反應(yīng)位點(diǎn)與填料基架之間有 10 個(gè)原子的間隔臂，而 CNBr 則沒(méi)有，對(duì)于小分子配基（＜5KDa），當(dāng)配基和樣品結(jié)合的時(shí)候，由于 CNBr 沒(méi)有間隔臂，可能會(huì)由于空間位阻而影響結(jié)合，在這種情況下，建議使用 NHS 活化配基填料。對(duì)于大于 5KDa 的配基，二者差異不大。