核酸擴(kuò)增法中LOD的可靠性取決于支原體菌株質(zhì)量的原因

本文核心要點(diǎn)速覽：

1. 死菌DNA會(huì)導(dǎo)致支原體核酸檢測的LOD虛假偏低
2. 菌株的GC/CFU比值是評(píng)估其質(zhì)量的核心指標(biāo)
3. 方法驗(yàn)證必須使用經(jīng)過標(biāo)定的菌株

在基于核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）的支原體檢測中，檢測限（LOD）常被視作方法靈敏度的核心指標(biāo)。然而，在實(shí)際的方法學(xué)驗(yàn)證與應(yīng)用中，一個(gè)常被忽視的問題是：

LOD的可靠性首先取決于支原體菌株的質(zhì)量。

支原體檢測qPCR擴(kuò)增

01 NAT檢測的本質(zhì)：檢測支原體核酸
與培養(yǎng)法不同，NAT方法直接檢測支原體DNA信號(hào)，這意味著：
✦ NAT無法區(qū)分活菌與死菌
✦ 檢測結(jié)果高度依賴樣品中的基因拷貝數(shù)（GC）
 

dPCR檢測支原體GC

對(duì)于支原體菌株，行業(yè)通用的生物學(xué)定量單位是菌落形成單位（CFU），關(guān)鍵在于，GC與CFU之間并不存在恒定比例關(guān)系。
 

 
支原體固體平皿培養(yǎng)

02 GC/CFU比值：影響LOD的關(guān)鍵但隱蔽因素
在支原體菌株制備過程中，常面臨以下挑戰(zhàn)：

支原體液體培養(yǎng)

• 支原體易聚集，難以均勻分散。
• 不同種類支原體培養(yǎng)條件差異大，工藝復(fù)雜。
• 支原體個(gè)體微小，不易直接觀察計(jì)數(shù)。
• 培養(yǎng)過程中容易產(chǎn)生死菌。
• 死菌會(huì)釋放游離DNA，顯著抬高GC含量。

當(dāng)GC/CFU比值過高時(shí)：

• LOD在數(shù)據(jù)上看似更低。
• 實(shí)際檢測信號(hào)可能主要來源于死菌核酸。
• 對(duì)于核酸檢測而言，高濃度的檢測對(duì)于檢測體系要求反而更低。
• 導(dǎo)致核酸法靈敏度被“虛假放大”。

03 行業(yè)共識(shí)：并非所有菌株都適合用于LOD驗(yàn)證
當(dāng)前行業(yè)普遍認(rèn)同：

• ATCC提供的標(biāo)準(zhǔn)支原體菌株在一致性和可追溯性方面更具優(yōu)勢。
• 多數(shù)合格菌株的GC/CFU比通�？刂圃�10以下（除非另有說明）。
• 應(yīng)選擇適用于NAT方法LOD驗(yàn)證和方法學(xué)確認(rèn)的菌株。

EP 2.6.7草案（Pharmeuropa 36.1）對(duì)于菌株的要求：

• 支原體應(yīng)在生長的指數(shù)階段收獲，以保證菌株活性。
• 應(yīng)在凍存工作懸浮液/稀釋液之前測定CFU。
• CFU的測定應(yīng)進(jìn)行一定數(shù)量的重復(fù)。
• 對(duì)于基因組拷貝數(shù)(GC)的測定，必須同時(shí)考慮上清和細(xì)胞這兩種組分。
• 確定GC/CFU比值的接受標(biāo)準(zhǔn)：除非另有說明，否則參考品的GC/CFU比值應(yīng)小于10。